http___www.irb.hr_Istrazivanja_Zavodi_Zavod-za-organsku-kemiju-i-biokemiju_Laboratorij-za-biokemiju-proteina-i-molekulsko-modeliranje_Razjasnjavanje-fizioloskih-uloga-ljudske-dipeptidil-peptidaze-III_1.xml
1.1 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.2 4.3 5.1 5.2 6.1 6.2 6.3 6.4 7.1 8.1 9.1 10.1 11.1 12.1 13.1 13.2 14.1 15.1 16.1 17.1 18.1 19.1 19.2 19.3 20.1 20.2
Elucidation of the physiological roles of human dipeptidyl peptidase III Proteolytic enzymes (peptidases) participate in and regulate an increasing number of important cellular processes by specifically cleaving their target proteins. Although structurally and biochemically very well characterized, many peptidases still lack information about their specific substrates and physiological roles. Dipeptidyl peptidase III (DPP III) is the cytosolic metallopeptidase that is well characterized at the structural and enzymatic level, however its physiological roles are still largely unknown. DPP III peptidase activity towards four to ten amino acid long oligopeptides indicates its role in the terminal stages of protein turnover, while its activity, and affinity towards certain biologically active peptides indicates its role in the pain modulation, blood pressure control, and inflammation. Furthermore, its involvement in the oxidative stress response through the interaction with Keap1 protein has been well documented. However, none of the proposed roles of DPP III have been proven, yet, and there are indications that it might also have other roles in the cell physiology. Its proposed role in Nrf2/Keap1 pathway, taken together with its overexpression in tumor tissues of several different tumor types, indicate that it might be a biomarker of certain types of cancer or even the target for anticancer therapy. The aim of this project is to elucidate the physiological roles, and disease relevance of DPP III by determining its interactors through the combined use of different molecular biology approaches. We plan to use yeast two-hybrid method to identify novel interacting partners of DPP III, and mass spectrometry interactome analysis to identify protein complexes DPP III takes part in. We plan to confirm the interactions found by Y2H and MS approach by several low-throughput methods. Finding DPP III interactors would enable us to identify other signaling pathways DPP III might be involved in. We will also test if any of newly identified DPP III interacting proteins are also DPP III substrates. Apart from gaining new insights into physiology of DPP III, this project will also enable transfer of technology and knowledge to the Ruđer Bošković Institute, which will have a positive impact on our future research efforts, and represent the first step towards procuring continuous research funding from EU funds. Principal Investigator Koraljka Husnjak, PhD Institute of Biochemistry II, Goethe University School of Medicine, Frankfurt am Main, Germany Co-Principal Investigator Associates - Marija Abramić, PhD, IRB, LBPMM - Zrinka Karačić, mag. chem., IRB, LBPMM - Ana Tomašić Paić, IRB, LBPMM - Snježana Jurić, IRB, LBPMM - Akmaral Kussayeva, PhD, LBPMM, IRB - Sara Matić, MSc, LBPMM, IRB Activities on the Project Mihaela Matovina visited dr. Koraljka Husnjak Laboratory at the Institute of Biochemistry II, Medical School of Goethe University in Frankfurt am Main, from October 2nd to 22nd 2016. During the visit, she performed Y2H experiments aimed at determining DPP III protein interaction partners on the whole proteome scale. Zrinka Karačić, Ana Tomašić Paić and Mihaela Matovina participated at 3rd DPP III Minisymposium on February 10th, 2017 in Graz, Austria. Mihaela Matovina presented the poster entitled „Methodology of DPP III interactome analysis“.
1.1 2.1 2.2 3.1 3.2 4.1 4.2 5.1 5.2 5.3 6.1 6.2 6.3 7.1 8.1 8.2 9.1 10.1 11.1 12.1 12.2 13.1 14.1 14.2 15.1 15.2 16.1 16.2 17.1 18.1 18.2 19.1 20.1 20.2 20.3 20.4 21.1 21.2 22.1 22.2 22.3 22.4
Razjašnjavanje fizioloških uloga ljudske dipeptidil peptidaze III Proteolitički enzimi (peptidaze) sudjeluju u regulaciji velikog broja ključnih procesa u stanici specifičnim cijepanjem odabranih ciljnih proteina. Iako su strukturno i biokemijski detaljno okarakterizirane, za mnoge peptidaze još uvijek nedostaju podaci o njihovim specifičnim supstratima i fiziološkoj ulozi. Dipeptidil peptidaza III (DPP III) je citoplazmatska metalopeptidaza detaljno okarakterizirana na strukturnoj i enzimatskoj razini, ali njezina fiziološka uloga još je gotovo potpuno nepoznata. Aktivnost DPP III peptidaze prema četiri do deset aminokiselina dugim peptidima sugerira njenu ulogu u završnim fazama razgradnje proteina, dok njezina aktivnost i afinitet prema nekim biološki aktivnim peptidima upućuje na njenu ulogu u regulaciji boli, krvnog tlaka i upali. Nadalje, uključenost DPP III u odgovor na oksidativni stres putem interakcije s proteinom Keap1 detaljno je opisana, međutim niti jedna od predloženih funkcija proteina DPP III još nije dokazana, a također postoje indikacije da bi mogao imati ulogu i u drugim fiziološkim procesima u stanici. Predložena funkcija u signalnom putu Nrf2/Keap1, kao i česta prekomjerna ekspresija proteina DPP III u različitim tipovima tumora, sugeriraju da bi mogao biti korišten kao tumorski biljeg ili čak meta antitumorske terapije. Cilj ovog projekta je određivanje fiziološke uloge i važnosti proteina DPP III u bolesti određivanjem njegovih interakcijskih proteina pomoću različitih molekularno-bioloških metoda. U radu ćemo koristiti tzv. metodu "yeast two-hybrid" (Y2H) za identifikaciju novih interakcijskih partnera proteina DPP III, kao i masenu spektrometriju (MS), za identifikaciju proteinskih kompleksa koji uključuju DPP III. Namjeravamo potvrditi interakcijske partnere proteina DPP III dobivene metodom Y2H i MS korištenjem nekoliko dodatnih metoda. Potvrđeni interakcijski partneri pomoći će nam u identifikaciji signalnih puteva koji uključuju DPP III. Također ćemo testirati da li su novoidentificirani interakcijski partneri proteina DPP III i njegovi supstrati. Osim dobivanja uvida u fiziologiju proteina DPP III, ovaj projekt omogućit će prijenos tehnologije i znanja u Institut Ruđer Bošković, što će pozitivno utjecati na naš budući znanstveni rad, kao i predstavljati prvi korak u osiguravanju trajne financijske potpore istraživanja iz europskih fondova. Voditeljica projekta Dr. sc. Koraljka Husnjak Institute of Biochemistry II, Goethe University School of Medicine, Frankfurt, Njemačka Suvoditeljica projekta Suradnici na projektu - Dr. sc. Marija Abramić, IRB, LBPMM - Zrinka Karačić, mag. chem., IRB, LBPMM - Dr. sc. Ana Tomašić Paić, IRB, LBPMM - Dr. sc. Snježana Jurić, IRB, LBPMM - Dr. sc. Akmaral Kussayeva, LBPMM, IRB - Sara Matić, mag. mol. biol., LBPMM, IRB - Dr. sc. Iva Pavlović, IRB, LBPMM Aktivnosti na projektu Mihaela Matovina je od 2.- 22.10.2016. bila u posjetu Laboratoriju dr. sc. Koraljke Husnjak na Institutu za biokemiju II, Medicinskog fakulteta Goethe Sveučilišta u Frankfurtu i radila pokuse tzv. Dvostrukog hibridnog sustava kvasca (eng. Yeast-two-hybrid system, Y2H) za određivanje interakcijskih partnera proteina DPP III na razini cijelog ljudskog proteoma. Zrinka Karačić, Ana Tomašić Paić i Mihaela Matovina su 10.2.2017. sudjelovale na 3. minisimpoziju o DPP III u Grazu, Austrija. Mihaela Matovina je imala poster pod naslovom „Metodologija analize DPP III interaktoma“. Koraljka Husnjak bila je u posjetu IRB-u 13. travnja 2017. Za vrijeme posjeta raspravljali smo o ostvarenju radnog plana te je Koraljka Husnjak pripremila staničnu kulturu mišjih embrionalnih fibroblasta (engl. MEFs, mouse embryonic fibroblasts) iz embrija s divljim tipom DPP III i embrija miševa iz kojih je izbačen DPP III gen (DPP III knock-out miševi). Navedene stanične linije planiramo koristiti za pokuse u suradnji s Laboratorijem za mitohondrijsku bioenergetiku i dijabetes s IRB-a i suradnicima s Instituta za biokemiju, Tehnološkog Sveučilišta u Grazu, Austrija.