خالص سازی کمپلکس elF4E/elF4G/Pab1p با استفاده از -mRNA ی کلاهک دار در مخمر Saccharomyces cerevisiae

پروتئین سازی یکی از پدیده های پیچیده سلولی است که عوامل متعددی در مراحل مختلف آن دخالت دارند.پیچیده ترین مرحله در پروتئین سازی, مرحله آغاز ترجمه است.تاکنون فاکتورهای مختلفی در مرحله شروع ترجمه شناسایی شده و با مطالعات بیوشیمیایی و ژنتیکی و ساختمانی آنها, اطلاعات دقیق تری در مورد عملگرداین فاکتور ها در اختیار ما قرار خواهد گرفت.در مخمر S. cerevisiae, elF4E جز اصلی و مرکزی کمپلکس elF4F می باشد که به طور مستقیم به ساختمان کلاهک موجود در 5mRNA متصل می شود. این کمپلکس از چندین نظر اهمیت می باشد.اولاً این کمپلکس از طریق دخالت در واکنش ریبوزومها با انتهای 5mRNA برای شروع ترجمه ضروری می باشد.ثانیاً به علت نقش این کمپلکس در واکنش با انتهای5mRNA و همچنین پروتئین های دیگر نظیر PABP )پروتئین متصل شونده به دم Poly A ( که در انتهای mRNA 3 می باشند, elF4Fمی تواند در روند تخریب mRNA دخالت داشته باشد.ثالثاً به علت دخالت elF4F در مسیر انتقال سیگنالی که توسط استرس یا هورمون ها القا می گردد, این کمپلکس می تواند محلی برای تنظیم ترجمه باشد.در این مطالعه, در شرایط خاصی کمپلکس eIF4E/eIF4G/Peb1P/RNA را به دست آوردیم که از این کمپلکس می توان برای مطالعه واکنش های متقابل eIF4E در کمپلکسelF4F و مطالعات ساختمانی این اجزا در مخمّر cerevisiae S. استفاده کرد.برای این منظور mRNA کلاهک دار به طول 55نوکلئوتید را با استفاده ازBiotin-21-UTP در انتهای mRNA 3 با روش in vitro transcription تهیه گردید.برای جداسازی mRNA بیوتینه شده از رزین Soft Link Avidin استفاده شد که در شرایط eIF4Eبه کلاهک موجود در انتهای 5mRNAوPab1p به انتهای mRNA 3 متصل می گردد.نتایج ما نشان می دهد که می توان با استفاده از شرایط خاص کمپلکس eIF4E/eIF4G/Peb1P/MRNA با درجه خلوص بالا را بدست آورد و از این کمپلکس برای مطالعات کریستالوگرافی استفاده نمود.