اتصال توالی های ژنی کدکننده ی نواحی اپی توپی پروتئین های غیرساختاری ویروس تب برفکی به روش OE-PCR یک مرحله ای

هدف: تب برفکی یک بیماری بسیار ویرانگر در حیوانات زوج سم می باشد که خسارات اقتصادی گسترده ای در صنعت دامپروری ایجاد می کند. اخیرا روش های تشخیصی این بیماری برای ردیابی آنتی بادی های علیه پروتیین های غیرساختاری ویروس تب برفکی بسیار توسعه یافته اند. پروتیین های غیرساختاری 3ABC و 3D که ارایه دهنده ی اپی توپ های خطی سلول های B هستند, تشخیص موثر دام های آلوده به ویروس را امکان پذیر می کنند. در این تحقیق, اپی توپ های خطی ایمنی زای غالب از پروتیین های 3ABD برای طراحی ساخت توالی ژنی جدید و اتصال قطعات 3AB و 3D در نظر گرفته شد. مواد و روش ها: از تکنیک گسترش نواحی همپوشان به کمک واکنش زنجیره ای پلیمراز (OE-PCR) برای سنتز توالی 3ABD آنتی ژنی استفاده شد. RNA ویروسی از سلول های BHK آلوده به ویروس جداسازی و رونویسی معکوس شد. برای حذف توالی میانی 654 نوکلیوتیدی ژن3C, یک جفت آغازگر داخلی با 29 نوکلیوتید همپوشان و یک جفت آغازگر خارجی طراحی شدند. قطعات 3AB و 3D هرکدام در واکنش های جداگانه ی PCR تکثیر شدند و پس از الکتروفورز از ژل تخلیص شدند. این قطعات به عنوان الگو در OE-PCR برای سنتز توالی 3ABD به کمک آغازگرهای خارجی و آنزیم Pfuپلیمراز در یک واکنش یک مرحله ای مورداستفاده قرار گرفتند. نتایج: نتایج این مطالعه نشان داد که هرکدام از قطعات 3AB (418 جفت باز) و 3D (557 جفت باز) با توالی های همپوشان به ترتیب در انتهای '3 و '5 تکثیر شدند. OE-PCR منجر به تکثیر چندین قطعه شد و قطعه ی 3ABD با طول موردنظر (946 جفت باز) پس از توالی یابی تایید شد. تنها با در نظر گرفتن 29 جفت باز همولوژی در طراحی آغازگرهای همپوشان و یک آنزیم پلیمراز با دقت بالا, دو ناحیه ی اپی توپی از پروتیین های غیرساختاری ویروس تب برفکی (3’,-3AB و 5’,-3D) به هم متصل شدند. نتیجه گیری: توالی ژنی ساخته شده به روش OE-PCR یک مرحله ای, علاوه براین که نواحی آنتی ژنی پروتیین های غیرساختاری 3ABD ویروس تب برفکی را دارا می باشد, مشکلات مربوط به هزینه ی بالای سنتز پپتید را ندارد و می تواند گزینه ی مناسبی برای تولید پروتیین نوترکیب و بررسی امکان استفاده در تشخیص بیماری تب برفکی به روش الایزا باشد.