RCA -menetelmän hyödyntäminen geenikirjastojen kehittämisessä
Julin, Marja (2011)
Marja_Julin.pdf (611.0Kt)
Julin, Marja
http://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011062012329
Geenikirjastojen kokoa rajoittava tekijä on DNA:n transformaatio bakteereihin. Transformaatiota saadaan tehostettua lisäämällä DNA:n määrää. Silmukoimismenetelmän (RCA) avulla rengasmaista DNA:ta voidaan monistaa suuria määriä transformaatiota varten. Ongelmakohtana on kuitenkin RCA:n tuotteena syntyvän DNA-konkatameerin muokkaus transformoitavaan muotoon.
Perinteisesti tämä tehdään digestoimalla DNA-konkatameeri yhden perusyksikön pituisiksi juosteiksi ja liittämällä ne itsensä kanssa. Toinen kokeellisempi menetelmä on rekombinaation hyödyntäminen konkatameerin silmukoimisessa perusyksiköiksi. Tämän työn tarkoituksena oli vertailla menetelmien tehokkuuksia sekä optimoida digestio-ligaatio ja rekombinaatio-menetelmät mahdollisimman hyvän monistetun DNA:n transformaatiotehokkuuden saavuttamiseksi
Työssä kloonattiin cre-rekombinaasin tunnistuselementtinä toimiva LoxP kohdeplasmidiin. Tämän jälkeen monistettiin plasmidia RCA -menetelmällä ja testattiin entsyymi- ja DNA-konsentraatioiden sekä reaktioajan vaikutusta konkatameerin uudelleenjärjestämisessä transformoitavaan muotoon. Reaktioiden onnistumista seurattiin agaroosigeelielektroforeesin ja bakteeritransformaatioiden avulla.
Työssä havaittiin, että hypoteesi osui oikeaan ja rekombinaatiomenetelmä toimi paremmin kuin perinteinen menetelmä. Plasmidilla pIX/PAK100r-LoxP1 digestio- ligaatio-menetelmä tuotti pesäkkeen muodostavia yksiköitä 10 ng RCA reaktioseosta kohden 4,54E+07, kun rekombinaatio-menetelmällä päästiin 1,19E+08 määrään.