Guvernul României

Ministerul Muncii

Ş I Familiei

Sociale Protecţiei

Amposdru

Universitatea Tehnică

" Gheorghe

Fernande Boisson

Didier Leonard

Concluzii Generale

Referințe Bibliografice

Bază De Polizaharide

UNIUNEA EUROPEANĂ

magnetică nucleară V.2.2.3. Analiza morfologică V.2.2.4. Analiza termică V.3. Concluzii V.3. Obținerea hidrogelurilor pe bază de amidon și amidon modificat cu cloruri acide și cu poli (ε-caprolactonă) prin reticulare cu acid citric V.3.1. Principiul reacției V.3.2. Program experimental V.3.3. Analiza rezultatelor obținute V.3.3.1. Analiza structurală a hidrogelurilor V.3.3.1.1. Caracterizarea prin spectroscopie FTIR-ATR V.3.3.2. Analiza morfologică V.3.3.3. Analiza rezultatelor privind proprietățile de umflare în soluții apoase V.3.3.4. Analiza capacității de includere și eliberare a levofloxacinei V.3.3.5. Studiul matematic al procesului de eliberare a medicamentului V.4. Concluzii VI.

ix

INTRODUCERE

Materialele pe bază de polizaharide au deschis noi drumuri în domeniul biomedical și anume în cel al regenerării tisulare, al sistemelor de eliberare controlată a medicamentelor și al imobilizării celulare. Proprietățile importante ale polizaharidelor includ biocompatibilitatea, biodegradabilitatea, activitatea biologică controlabilă și abilitatea lor de a forma hidrogeluri.

Majoritatea polizaharidelor folosite sunt derivate din surse naturale, iar neajunsurile lor au impus noi metode sintetice de modificare chimică, scopul fiind de a promova noi activități biologice și de a modifica proprietățile finale ale acestora pentru scopuri specifice.

Eliberarea controlată a agenților bioactivi constituie un domeniu major al cercetărilor din ultimii ani. Au fost folosite metode variate pentru a elibera molecule biologic active în zone țintă și de a extinde durata lor terapeutică odată ajunse în corpul uman. Sistemele polimerice purtătoare de medicament au numeroase avantaje în optimizarea regimului de tratament al pacientului. Biomaterialele, în special copolimerii pe bază de amidon, sunt capabili de a elibera medicamente într-un ritm constant pe o perioadă îndelungată de timp. Pe de altă parte, amidonul nativ nu este adecvat în anumite sisteme de eliberare a medicamentelor, având în vedere proprietatea sa de a se umfla, ceea ce duce la o stabilitate scăzută pe termen lung cauzată de hidrofilia polizaharidului, faptul că este degradat enzimatic într-un ritm rapid în fluidele biologice, respectiv proprietățile sale mecanice slabe. Pentru a preîntâmpina cele enumerate anterior, au fost adoptate strategii sintetice de modificare fizică și chimică a polizaharidei, precum introducerea de grupări hidrofobe, ce duce la obținerea de polimeri amfifili astfel schimbând proprietățile acesteia, inclusiv vâscozitatea soluției, comportamenul de asociere și stabilitatea în cadrul produselor finale.

Produșii sintetici rămân totuși indispensabili pentru numeroase aplicații și nu este întotdeauna posibil a-i substitui cu o moleculă naturală. Ideea asocierii unei componente sintetice cu una zaharidică în cadrul aceleiași structuri chimice a condus la o nouă clasă de materiale ce întrunește proprietățile fizico-chimice ale fiecărui compus.

Poli(ε-caprolactona) și materialele pe bază de PCL au fost intens investigate pentru aplicațiile lor farmacologice și biomedicale, datorită prețului scăzut, degradării lente, permeabilității crescute pentru multe medicamente și netoxicității. Unul din cele mai reprezentative exemple de copolimeri biodegradabili hidrofobici și amfifilici este ilustrat în cazul poliesterilor și a polizaharidelor.

x În domeniul biomedical, copolimerii pe bază de polizaharide și-au găsit aplicabilitate ca sisteme de vectorizare a principiilor biologic active, ca suporturi pentru ingineria tisulară, ca agenţi de biocompatibilizare, în terapia genică, componenta naturală a acestora asigurând acceptarea de către organism a produsului străin.

Sinteza copolimerilor amfifili a fost intens studiată în principal datorită proprietății lor de autoasociere în medii apoase. Acest fenomen are loc când un copolimer conţine blocuri de natură diferită (hidrofob /hidrofil) și este dizolvat într-un solvent pentru care numai unul din blocuri prezintă afinitate. Autoasocierea va duce la formarea de particule cu o structură numită micelară, în care blocurile ce nu prezintă afinitate pentru solvent se vor dispune în interior, iar cele cu afinitate pentru solventul utilizat vor constitui un înveliș extern.

Un alt sistem de eliberare controlată este hidrogelul, material ce permite evitarea administrării frecvente, lucru extrem de benefic pentru comfortul pacientului. Hidrogelurile actuale ce se doresc a deveni instrumente de eliberare a medicamentelor sunt limitate de natura lor hidrofilă datorită eliberării rapide a acestora în faza inițială. Mai mult, datorită interacțiunilor hidrofobe, se pot forma agregate mari de medicament în timpul procesului de încărcare a acestuia, fapt ce poate conduce la o concentrație locală mare și poate cauza efecte secundare sau chiar toxicitate.

Scopul acestei lucrări este de a hidrofobiza amidonul pentru obținerea şi caracterizarea unor sisteme de eliberare a medicamentelor. Pentru aceasta, s-au sintetizat noi copolimeri pe bază de amidon, sistemele descrise fiind elaborate via «click chemistry » (CuAAC) între lanțurile de amidon purtătoare de funcții alchine laterale și lanțurile de policaprolactonă cu funcția azidică pe capătul terminal. Amfifilicitatea polimerilor obținuți depinde de lungimea lanțului de policaprolactonă, fiind proiectați pentru o viitoare utilizare în stabilizarea de nanoparticule purtătoare de principii biologic active. În paralel, au fost obținute hidrogeluri pe bază de amidon și amidon modificat cu lanțuri de acid gras și policaprolactonă, reticulate cu acid citric. A fost evaluată capacitatea lor de absorbție a apei și a eliberării de principii active.

.

I.1.1. Polimeri amfifili

Copolimerii bloc amfifili (amphi: de ambele tipuri; philic: cu afinitate pentru) sunt compuşi din cel puţin două subunităţi, dintre care una posedă proprietăţi de hidrofilie, iar cealaltă are un caracter hidrofob. În mod similar amfifililor cu masă moleculară redusă (lipide, surfactanţi), copolimerii bloc amfifili se auto-asamblează, folosind solvenţi bloc-selectivi, într-o varietate de structuri, precum micele, micele compuse, vezicule, tuburi, faze cristal-lichide liotropice 3 4 . Tipurile de morfologii pot fi controlate prin varierea compoziţiei copolimerilor, a concentraţiei iniţiale a copolimerilor în cadrul soluţiei, prin natura solventului comun, cantitatea de apă prezentă în mediu, prin temperatură, prin prezenţa aditivilor ca ioni, homopolimeri sau tensioactivi, respectiv prin polidispersitatea lanţurilor copolimerice 5 . Compoziţia copolimerilor este definită în mare parte de masa moleculară şi dimensiunile blocurilor homopolimere 6 .

Acestea din urmă reprezintă un parametru important, iar valoarea lungimii secvenţei blocurilor depinde de tipul auto-asamblărilor 7 .

În soluţiile diluate în anumiţi solvenţi (ex. solvent bun pentru un bloc dar precipitant pentru celălalt) copolimerii bloc manifestă comportament de autoasamblare. Lanţurile polimerice tind să se organizeze spontan într-o varietate de structuri, de la micele sferice sau cilindrice până la vezicule (Figura 1) 8 .

În cazul cel mai simplu al unei micele sferice, blocul solubil se va orienta către solvent şi va forma coroana, în timp ce partea insolubilă va fi protejată de solvent şi va forma miezul dens.

În comparaţie cu micelizarea surfactantilor cu o greutate moleculară mică, blocurile copolimerice pot genera agregate cu stabilitate cinetică şi termodinamica mare, fapt ce măreşte gama lor de aplicaţii. Spre exemplu, Zhang şi Eisenberg 9 au arătat că sferele, cilindrii şi veziculele au fost formate din copolimeri polistiren-co-poli(acid acrilic) PS200-co-PAA21, PS200-co-PAA15, PS200-co-PAA8, respectiv în soluţii dimetilformamida (DMF) / apa. Gradul alungirii PS pentru aceste trei tipuri de agregate a fost de 1,41, 1,26 şi 0,99 10 . Acest exemplu ilustrează modificările morfologice de la sfere la cilindri şi ulterior vezicule, pe măsură ce gradul de alungire se micşorează. Dependenţa morfologiei de concentraţie se poate vedea în mod clar în cadrul diagramelor de fază ale anumitor sisteme copolimerice. Shen şi Eisenberg au investigat formarea veziculelor PS-co-PAA, funcţie de concentraţia soluţiei de polimer 8,9 . Pentru un conţinut fixat de apă, veziculele s-au format pentru concentraţii ale copolimerului PS310-co-PAA52 mai mari decât aproximativ 0.6 wt. %. Cei doi au raportat, de asemenea, că, pentru majorarea concentraţiei polimerului de la 0.6 la 5.0 wt. %, diametrul mediu al veziculelor a crescut de la 90 la 123 nm. În general, odată cu mărirea concentraţiei soluţiei polimerice, morfologia agregatului tinde să se modifice în mod similar conform celor observate în cazul incrementării conţinutului de apă 11 .

Pentru a induce auto-asamblarea copolimerului, este adesea necesar un solvent comun, pentru a dizolva atât blocurile hidrofobe, cât şi cele hidrofile şi a forma o soluţie copolimerică înainte de adăugarea precipitantului. Alegerea solventului comun influenţează, totodată, morfologiile auto-asamblărilor obţinute 12 . Prin urmare, Yu et al. au arătat formarea de agregate sferice din PS500-co-PAA58 în DMF, vezicule fiind însă obținute când solventul inițial a fost tetrahidrofuran (THF) sau dioxan. Controlul morfologiei agregatelor bloc -copolimerice poate fi realizat nu doar aplicând solvenți simpli, ci și micști. Adăugarea apei servește la modificarea interacțiunilor polimer -solvent și la inducerea de schimbări morfologice și de auto-asamblare 13 14 15 . Aceeași situație poate fi atinsă într-un solvent simplu prin variații ale temperaturii aplicate. Cu toate acestea, au fost raportate modificări ale auto-asamblării copolimerului bloc induse de temperatură pentru sisteme polimerice constituite în cea mai mare măsură din poli(etilen glicol) termoresponsiv 16 sau din blocuri din polielectroliţi. Aspectele experimentale ale influenţei forţei ionice, pH-ului 17 , ale sării adăugate şi homopolimerilor au fost investigate folosind în principal sisteme copolimerice bloc amfifilic pe bază de polielectroliţi. În general, comportamentul de auto-asamblare al copolimerilor bloc amfifili poate fi influenţat de o varietate de factori dinstincţi. Cu toate acestea, există teorii ce conferă direcţii pentru raţionalizarea morfologiilor observate şi care pot fi utilizate în predicţia tipului de structuri auto-asamblate 18 . Din altă perspectivă, influenţa compoziţiei macromoleculare sau a solventului comun asupra auto-asamblării polimerului poate fi exploatată cu scopul construirii tipului şi proprietăţilor agregatelor. În plus, auto-asamblarea macromoleculară este mai degrabă tolerantă faţă de introducerea diverselor grupuri funcţionale, ceea ce permite totodată existenţa proprietăţilor de reglare a ansamblurilor, pentru aplicaţii specfiice. Acesta este unul dintre avantajele principale ale auto-asamblării polimerice, faţă de cea din compuşi de masă moleculară redusă, precum lipidele şi surfactanţii. Alte avantaje sunt reprezentate de posibilitatea de a introduce mecanisme adiţionale pentru stabilizarea coloidală, de controlul concentraţiei micelare critice a polimerului (CMC), permeabilitatea scăzută şi stabilitatea îmbunătăţită a membranelor polimerului amfifilic şi pot fi folosite în diverse aplicaţii tehnologice 19 .

Este utilă menţionarea faptului că sistemele biologice implică amfifili similari polimerilor (proteine, polizaharide) în rezolvarea problemelor de stabilizare a heterofazei. Acesta este un indiciu clar pentru cercetătorii în ştiinţa materialelor: arhitectura macromoleculară a copolimerilor amfifili şi asamblarea acestora la diferite scale de lungime, de timp, respectiv niveluri de interacţiune, fac utilizarea acestor compuşi foarte atractivă. Cele mai interesante exemple de aplicaţii potenţiale sunt reprezentate de eliberarea de substanţe diverse , diagnoză medicală şi reconstituirea de molecule biologice 20 . Dintre diferitele auto-asamblări polimerice, micelele şi veziculele au fost utilizate mai ales în biotehnologie. Spre exemplu, acestea servesc atât drept purtători de molecule hidrofobe (în capsula hidrofobă), cât şi drept compuşi hidrofili (în interiorul apos) 21 .

Polimerii amfifili au fost intens studiaţi pe parcursul ultimilor treizeci de ani. Aceştia au fost iniţial obţinuţi prin copolimerizarea monomerilor cu suprafeţe active (ceea ce a condus la obţinerea cunoscutelor polisăpunuri). A fost vizată combinarea dintre caracteristicilor macromoleculelor şi comportamentul de suprafaţă activă al unităţilor individuale. Polimerii obţinuţi prin această metodă au format agregate intramoleculare, denumite "coliere", chiar şi la concentraţii foarte reduse, şi au prezentat o foarte redusă solubilitate în apă. Legăturile permanente dintre unităţile cu suprafeţe active au favorizat agregarea acestora în mod termodinamic, deoarece acesta a redus semnificativ pierderea entropică ce însoţeşte agregarea unităţilor individuale.

Ulterior, au fost sintetizaţi alţi polimeri amfifili, prin combinarea marii majorităţi a unităţilor hidrofile cu doar câteva de tip hidrofob. În mod opus polisăpunurilor, acest tip de macromolecule dispune de "un caracter amfifil global/general", determinat de prezenţa secvenţelor hidrofile şi hidrofobe în cadrul lanţurilor (în loc să fie lanţuri formate din unităţi amfifile individuale). Astfel de polimeri sunt în generali solubili în apă (în funcţie de cantităţile diferitelor unităţi) şi formează asocieri intermoleculare caracterizate de concentraţii suficient de ridicate 3 . Într-adevăr, în plus faţă de suprapuneri între molecule, tendinţa termodinamică a grupurilor hidrofobe de a se asocia pentru a minimiza contactele cu mediul înconjurător apos (efect hidrofob) crează interacţiuni suplimentare între macromolecule. Aceasta conduce la formarea unei reţele reticulate fizic şi deci la soluţii apoase cu vâscozităţi ridicate (polimeri asociativi).

Un volum semnificativ de lucru a fost dedicat comportamentului soluţiilor polimerice apoase semidiluate şi concentrate. În particular, a fost demonstrat că nivelul de vâscozitate poate fi considerabil modificat prin intermediul varierii atât a naturii unităţilor hidrofobe, cât şi a distribuţiei acestora în cadrul lanţurilor polimerice. La interfeţele dintre faza apoasă şi suprafaţa hidrofobă, aceste macromolecule adsorb şi conduc la formarea unui strat polimeric dens 22,23 .

În cazul interfeţelor lichid -lichid, acest strat polimeric conduce la obţinerea unui răspuns mecanic specific la deformarea suprafeţei. Acesta este sursa proprietăţilor de emulsionare ale macromoleculelor amfifile. Pentru interfeţele solid -lichid, suprafaţa solidă este acoperită cu un strat polimeric ce controlează interacţiunile dintre particule şi mediul ambient. În general, stratul polimeric este suficient de dens pentru a preveni agregarea determinată de atracţiile Van der Waals. O altă caracteristică importantă a adsorbţiei macromoleculelor la interfeţe este reprezentată de "ireversibilitatea cinetică" a acestui proces. Într-adevăr, desorbţia unui macromolecule individuale necesită desorbţia simultană a tuturor unităţilor hidrofobe din interfaţă, un caz foarte puţin probabil. Prin urmare, dispersiile stabilizate polimeric pot fi în general diluate fără destabilizare, fapt important în varii situaţii 22 .

Sinteza polimerilor amfifili a fost realizată în principal prin două metode. Cea dintâi se bazează pe copolimerizarea a cel puţin doi monomeri, unul hidrofil şi unul hidrofob. Distribuţia diferitelor unităţi în cadrul lanţurilor este controlată în mare măsură de structura chimică a monomerilor (rapoarte de reactivitate) şi de către mediul de reacţie (omogen, eterogen, micelar etc.). S-a demonstrat că prin intermediul cantităţii de surfactant din copolimerizarea micelară se poate controla caracterul de bloc al copolimerilor amfifili.

Cealaltă procedură implică modificare chimică a unui polimer hidrofil existent, prin ataşarea de grupări hidrofobe. În acest caz, distribuţia unităţilor hidrofobe în lungul scheletului hidrofil este controlată în principal de către mediul de reacţie. Folosind aceste două strategii de sinteză şi datorită abundenţei de structuri chimice, a fost posibilă obţinerea de polimeri amfifili ce prezintă sensibilitate la alte variabile fizico -chimice, precum temperatura, tăria ionică, radiaţiile UV vizibile şi altele. Această situaţie conduce la obţinerea de sisteme coloidale ce prezintă comportamente originale: variaţie inversă a vâscozităţii în funcţie de temperatură, modificarea tipului de emulsie prin iradiere UV sau tărie ionică, comportament polielectrolitic etc.

Nu demult au fost emise noi cerinţe legate de mediu. S-a manifestat un interes crescând pentru polimerii amfifili obţinuţi surse regenerabile, biodegradabili şi biocompatibili. Solicitări similare au rezultat şi din noi tipuri de aplicaţii legate de domeniul biomedical, precum materialele pentru repararea de ţesuturi, respectiv dispozitivele de eliberare de medicamente. Această situaţie a condus la utilizarea de noi materiale, precum polizaharidele, pentru prepararea polimerilor amfifili. Polimerii hidrofili de tipul polizaharidelor prezintă proprietăţi interesante, precum biodegrabilitatea şi biocompatibilitatea, putând fi modificaţi din punct de vedere chimic, cu scopul obţinerii de polimeri amfifili.

Pionieratul utilizării micelelor polimerice ca sisteme pentru eliberarea de medicamente a fost realizat de grupul lui Ringsdorf în 1984 24 . În prezent, micelele polimerice sunt intens studiate ca un foarte promiţător purtător nanoscopic de medicamente 25 , datorită atractivelor caracteristici de pe care le prezintă, ce respectă necesităţile eliberării selective de medicamente .

Un aspect important este că miezul micelar hidrofob dispune de o capacitate ridicată de acomodare a medicamentelor hidrofobe. Au fost recent cercetate micele polimerice şi ca sistem de eliberare medicamentoasă orală 26 , dar acestea erau iniţial considerate ca fiind cele mai potrivite pentru administrare intravenoasă. O largă varitate de medicamente, precum doxorubicin, paclitaxel, cisplatin, indomethacin şi altele, au fost încorporate în micele polimerice şi testate pentru aplicaţii de eliberare de medicamente. Încărcarea şi eliberarea acestora prin intermediul micelelelor polimerice şi abordările de optimizare constantă a eficienţei acestor sisteme de eliberare pe bază de polimeri sunt corespunzător descrise în cercetările lui Rijcken et al. 27 , respectiv Rösler şi coautorii săi 28 . Auto-asamblările veziculare polimerice au fost, de asemenea, utilizate ca purtători de medicamente 29 , cu toate că au fost obţinute sisteme mai complexe prin inserţia de proteine naturale în membrane veziculare .

A fost însă necesară parcurgerea a numeroşi paşi până la atingerea acestui punct, începând cu strategii de sinteză, urmate de analize complexe asupra auto-asamblării copolimerilor, folosind diverse tehnici. Sinteza copolimerilor bloc amfifili reprezintă cheia determinării structurii, functionalităţii şi proprietăţilor ansamblurilor potenţiale. Prin urmare, trebuie făcută o alegere atentă a abordării sintetice, pentru a obţine polimeri amfifili de compoziţia, masa moleculară şi polidispersitatea vizată.

Procesul de asamblare este guvernat de două forţe opuse, atracţia dintre compuşii insolubli şi repulsia dintre părţile solubile. Competiţia dintre aceste forţe depinde de geometria moleculelor. Prin urmare, morfologa rezultantă a bloc copolimerilor în soluţiile diluate poate fi prevestită folosind consideraţiile geometrice.

Israelachvili şi colab. 30 au dezvoltat o abordare foarte accesibilă prin introducerea unui parametru de asamblare ce este în legatură cu alti trei parametri geometrici:

p = ecuația (1)
unde v este volumul ocupat de lanţurile hidrofobice şi a 0 reprezintă interfaţa optimă, iar l c este lungimea conturului lanţului hidrofobic (Figura 2). Tabelul 1 arată relaţia dintre p şi morfologia agregatului. Z 0 este în legatură cu parametrul de asamblare p, precum şi cu parametrul Flory-Huggins, χ, care ia în considerare atât interacţiunile polimer/polimer cât şi pe cele polimer/solvent, N A şi N B , fiind gradele de polimerizare ale blocurilor A respectiv B.

În funcţie de polaritatea solventului folosit, micelele bloc copolimerilor se pot împărţi în două tipuri: obişnuite şi inverse. Într-un solvent polar, cum este apa, se formează micelele obişnuite, cu un miez hidrofob şi un înveliş hidrofil, pe când într-un solvent apolar (sau de o polaritate joasă), localizarea blocurilor este inversată. În funcţie de lungimile relative ale lanţurilor bloc copolimerilor şi ale parametrului de interacţiune, fiecare tip de micelă se împarte în alte două tipuri de structuri micelare.

Când N A >> N B , vom avea "micela crew cut" (a), cu un miez mult mai mare decât stratul exterior 32 .

Când N A << N B , se formează micele sub formă de stea (b) cu un miez mult mai mic decât coroana. Dacă parametrul corespunzător interacţunilor dintre două blocuri χAB, este comparabil cu cel care descrie interacţiunile polimer/solvent al unui bloc χAS, şi acestea două sunt mult mai mari decât cel pentru interacţiunile polimer/solvent ale celuilalt bloc, χBS, atunci miezul micelei constă în principal din blocuri de tip A, coroana este alcătuită din B, umflat cu solvent, deşi în faza solventului nici un bloc copolimeric nu este prezent.

Relaţiile de scalare între raza micelei, R, numărul de agregare, Z şi gradele de polimerizare sunt descrise în Tabelul 2. Tabelul 2.

Structura micelară

Raza R Numărul de agregare Z Stea ~NA ~NA Interacţiunea dintre polimeri şi moleculele de mici dimensiuni din substanţa dizolvată, precum surfactanţii sau particulele coloidale, atrage un interes semnificativ datorită potenţialului extins de aplicare industrială şi importanţei biologice 33 . Spre exemplu, polimerii sunt utilizaţi în controlul stabilităţii suspensiilor coloidale , micelele copolimerice bloc sunt folosite la eliberarea localizată de coloizi mici 34 , dar, în mod esenţial, interacţiunea dintre biopolimeri şi proteine sau fosfolipide membranare prezintă un interes fundamental. În plus, interacţiunile dintre polimeri hidrofili şi grupări din particule coloidale mari 35 36 , sau micele reprezintă un subiect de cercetare intensă.

Prezenţa polimerilor hidrofili induce formarea de agregate polimersurfactant sub forma de micele acoperite cu lanţuri polimerice 37 . Această asociere colaborativă are de obicei loc sub concentraţia micelară critică (CMC) a surfactanţilor. Particule coloidale de mari dimensiuni formează agregate împreună cu polimerii, acolo unde există lanţuri polimerice hidrofile înfăşurate în jurul particulelor coloidale. Lanţurile polimerice pot lega între ei diferiţi coloizi, conducând la formarea de aglomerări de coloizi sau gel 34 . La rândul lor, mai multe lanţuri polimerice adsorbi pe aceeaşi particulă coloidală, formând şi stabilizând coroana hidrofilă. O caracteristică importantă a acestui tip de agregate este că adsorbţia este reversibilă, particulele coloidale putând aluneca eficient în lungul lanţului. În cazul multor lanţuri lungi adsorbite pe aceeaşi particulă coloidală, gradul de libertate aferent alunecării conduce la formarea de agregate în formă de stea, cu un număr variabil de braţe.

Asocierea sinergetică a copolimerilor bloc cu molecule de mici dimensiuni se poate caracteriza prin procesabilitate şi auto-asocierea copolimerilor bloc cu funcţionalitatea chimică amplă a moleculelor mici. Spre exemplu, Ikkala şi colab. au dezvoltat o metodă versatilă de a construi supramolecule prin ataşarea de molecule mici la capătul lanţului polimeric, prin intermediul legăturilor de hidrogen, al interacţiunilor electrostatice sau coordinarea metalului 38 .

Capacitatea suprafeţelor hidrofile, în special a acoperirilor bazate pe poli(etilen glicol) (PEG), de a rezista la absorbţia de proteine a fost demonstrată în mai multe studii.

Acoperirile cu copolimeri bloc amfifili, ce conţin compuşi PEG-ilaţi şi fluoroalchilici au prezentat forţe de interacţiune extrem de reduse cu moleculele proteice 1 .

În cele ce urmează, sunt descrise un set de tehnici de sinteză utilizate în mod obişnuit pentru prepararea diferitelor tipuri de copolimeri amfifili. Metodele curente de sinteză solicită de obicei tehnici de polimerizare "vie", precum polimerizarea anionică, cea cationică sau cu transfer de grup . Abordările de polimerizare vie prezintă avantajul realizării polimerilor cu distribuţie restrânsă a masei moleculare, respectiv cu grade predeterminate de polimerizare ce depind exclusiv de raportul molar dintre monomer şi concentraţia iniţiatorului. Cu toate acestea, atunci când una dintre componente nu poate fi polimerizată conform unui mecanism viu, sunt posibile următoarele variante: sinteza pornind de la macromonomeri sau încapsularea cu grupări terminale speciale pentru reiniţializarea transferului în lanţ, sau oprirea acesteia. Pentru majoritatea procedurilor de sinteză, se impune a fi îndeplinite condiţii de puritate ridicată a reactanţilor, protocoale de izolare puţin consumatoare de timp şi/sau protejarea unor grupări chimice. Toate metodele de sinteză au fost discutate şi documentate detaliat de către Floudes și colab. 39 , de Gnanou și colab. săi 40 precum și de Forster 41 . Mai jos, sunt prezentate pe scurt o parte din tehnicile ce implică creşterea secvenţială de blocuri prin polimerizare vie, urmând o descriere mai cuprinzătoare a polimerizării radicalice prin transfer de atomi (atom transfer radical polymerization, ATRP). Această ultimă tehnică este avută în vedere datorită utilizării ei în prepararea copolimerilor bloc amfifili în soluţie şi pe suprafeţe.

Caracterizarea surfactanţilor din punct de vedere al grupărilor ce prezintă cap hidrofil conduce la patru grupe distincte: Precum a fost descris în Figura 4, sufractanţii din soluţie formează la suprafaţă, pentru concentraţii reduse, straturi de adsorbţie. Această situaţie determină o reducere a tensiunilor superficiale, proporţională cu majorarea concentraţiei surfactantului, până în momentul în care stratul de adsorbţie este extrem de dens. Figura 6 prezintă în mod schematic adsorbţia la suprafaţă a moleculelor de surfactant, până în momentul atingerii concentraţiei micelare critice (CMC). În acest punct (CMC), suprafaţa este complet acoperită cu molecule de surfactant, incrementarea concentraţiei acestuia determinând formarea de micele. Idei conceptuale creative au condus la un progres recent rapid în domeniul sistemelor de eliberare de medicamente (drug-delivery systems -DDS). Folosind sisteme eficiente, proprietăţile farmacologice şi terapeutice ale medicamentelor convenţionale pot fi îmbunătăţite în mod excepţional 1 . Sistemele de eliberare pot optimiza eficienţa şi reduce toxicitatea unui medicament, respectiv îmbunătăţi colaborarea şi satisfacerea pacientului.

Diversitatea limitată de materiale biocompatibile şi a tehnologiilor de asamblare a acestora restricţionează adesea comercializarea de DDS. Printre variatele tipuri de DDS, micelele polimerice au fost cercetate extensiv, datorită proprietăţilor lor remarcabile. În plus faţă de abilitatea de a stabiliza medicamente hidrofobe, micelele polimerice prezintă dimensiuni reduse ale particulelor, o distribuţie dimensională relativ îngustă, CMC redus, un ritm lent de disociere şi previn absorbţia rapidă de către sistemul reticuloendotelial.

Micelele se înscriu între câteva zeci şi mai multe sute de nanometri în diametru, facilitând integrarea sistemelor încărcate cu medicament în cadrul veziculelor endocitare, permiţând astfel inserarea în cadrul celulelor ţintă. Până în prezent, copolimerii bloc amfifili au fost cel mai des utilizaţi în fabricarea micelelor polimerice. În sistemele amfifile, segmentul hidrofob formează miezul micelei, iar cel hidrofil înconjoară miezul, stabilizând interiorul. În mod normal, ambele segmente conţin secvenţe repetitive de unităţi de structuri chimice biocompatibile. Datorită diversităţii limitate a unităţilor recurente, morfologia lanţurilor copolimerice a prezentat un interes principal.

Printre variatele forme ale moleculelor de copolimer, structura amfifilă de tip pieptene este unică, determinând proprietăţi morfologice interesante, precum comportamentul cristalin lichid. Au fost sintetizaţi multipli polimeri tip pieptene 43 , bazaţi pe poli(oxietilenă) . Conform analizei literaturii existente, nu s-a încercat utilizarea polimerilor tip pieptene drept purtător şi eliberator de medicamente, din cauza metodelor de sinteză complicate aferente. Tehnicile de polimerizare vie, precum polimerizarea anionică , sau cea radicalică şi cu transfer de atom, sunt adesea necesare pentru producerea lanţurilor laterale monodispersate corespunzătoare polimerilor tip pieptene.

În mod normal, segmentele hidrofile ale polimerilor amfifili au un efect mai redus asupra CMC decât cele hidrofobe.În general, majorarea lungimii blocurilor hidrofobe reduce CMC, cu toate că acest efect nu este întotdeauna evident.

Surfactanţii farmaceutici cu masă moleculară redusă utilizaţi în prezent prezintă o toxicitate scăzută şi o putere de solubilizare ridicată. Pe de altă parte, au dezavantajul că sunt caracterizaţi de o concentraţie micelară critică (CMC) destul de mare şi sunt instabili în cazul diluării intense. Cu toate acestea, prin utilizarea copolimerilor amfifili, aceste inconveniente pot fi eliminate, deoarece aceşti produşi dispun de o putere mare de solubilizare şi CMC redus, fiind astfel mai stabili in vivo 44 .

Luând în calcul aceste avantaje ale sistemelor de eliberare medicamentoasă, a fost dezvoltată o metodologie chemo-enzimatică pentru sinteza de polimeri amfifili funcţionalizaţi, fiind folosiţi poli(etilen glicol)i, PEG, deoarece aceştia sunt biocompatibili, netoxici şi solubili în apă. S-a demonstrat 45 că prin modificarea lungimii şi funcţionalităţii lanţului lateral, caracterul hidrofoc şi hidrofil relativ poate fi variat pe un interval generos. Datorită acestor modificări, miezul acestor nanoparticule poate fi, de asemenea, variat, pentru a fi conform caracteristicilor particulare ale unei molecule mici sau ale unui medicament.

I.1.2. Polizaharide amfifile

Majoritatea carbohidraţilor în natură se gasesc sub forma polizaharidelor, categorie ce include nu numai acele substanţe compuse doar din reziduuri glicozidice legate la zaharuri, dar şi din molecule ce conţin structuri zaharidice polimerice legate prin intermediul legăturilor covalente de amino acizi, peptide, proteine, lipide şi alte structuri.

Funcţia lor biologică de bază include: sursa de energie a naturii (care este indeplinită de către amidon şi glicogen), precum şi cea de material de structură (celuloza şi chitina). Carbohidraţii sunt cunoscuţi pentru faptul că îndeplinesc un ansamblu de roluri biologice dincolo de conţinutul descris mai sus. Cunoscut sub numele de glico-cod, carbohidraţii sunt în măsură să transmită o densitate ridicată de informaţii cu privire la diversitatea lor structurală. În polizaharide, informaţia poate fi exprimată prin numărul şi succesiunea de unităţi zaharidice, cu toate că sunt codate şi în poziţia şi configuraţia (α sau β) a unităţilor glicozidice.

Având potenţial pentru codarea informaţiei biologice, carbohidraţii joacă un rol important în procesele de recunoaştere celulă-celulă. Acest fapt poate fi atribuit proceselor de recunoaştere macromoleculară ce au loc la suprafaţa celulei şi implică un număr mare de diferite proteine capabile de legarea carbohidraţilor.

Carbohidraţii sintetici complecşi şi polimerii pe bază de carbohidraţi s-au evidenţiat ca agenţi bine definiţi pentru studierea rolului biologic al zaharurilor, datorită dificultăţii de extragere a glicoconjugatelor pure din surse naturale 46 .

În plus, polimerii ce conţin carbohidraţi s-au dezvoltat ca materiale avansate pentru investigarea interacţiunilor multivalente din aplicaţiile biomedicale, farmaceutice şi medicale.

Odată cu dezvoltările recente din tehnicile de polimerizare, au fost descrise variate tipuri de polimeri sintetici purtători de zaharuri 47,48 (figura 8), mai jos fiind ilustrate patru mari clase : a) polimeri liniari, conectaţi de obicei la poziţia anomerică cu alte grupări hidroxil adiacente resturilor de zahăr; b) polimeri pieptene, care sunt polimeri sintetici ce conţin zaharuri ca grupari laterale; c) macromolecule dendritice; d) hidrogeluri. Polizaharidele diferă nu doar prin natura componentei monozaharidice dar şi prin lungimea şi modul de ramificare a lanţurilor lor. Chiar dacă un rest zaharidic are doar un carbon anomeric şi poate forma doar o legatură glicozidică cu gruparile hidroxilice ale altei molecule, fiecare rest zaharidic poartă un număr de hidroxili, ce pot fi acceptori ai substituienţilor glicozilici. Această abilitate de a forma structuri ramificate distinge polizaharidele de proteine şi acizi nucleici, care apar doar ca polimeri liniari.

Principalele funcţii îndeplinite de polizaharide în natură sunt fie de stocare, fie de element structural. Cel mai comun polizaharid de stocare în plante este amidonul, care există în două forme αamiloza şi amilopectina.

Polizaharidele structurale prezintă proprietăţi foarte diferite de cele ale polizaharidelor de stocare, chiar dacă compoziţia acestor două clase este similară. Celuloza, polizaharidă Polizaharidele stabilizate în emulsii ulei-apă pot servi ca intermediari în prepararea nanoparticulelor acoperite de polizaharide, ce pot avea aplicaţii în sistemele de eliberare a medicamentelor. Controlul proprietăţilor nanoparticulelor (dimensiune, înveliş) este realizată printr-o cunoaştere precisă a câtorva parametri cum ar fi vâscozitatea fazei continue (o soluţie apoasă de polimer amfifil) şi de proprietăţile fizice ale emulsiei iniţiale (variaţia mărimii cu timpul, stabilitatea cu temperatura, vâscozitatea,etc).

I.1.2.1. Metode de obţinere

Deoarece majoritatea polizaharidelor sunt de fapt polielectroliti, caracterul lor hidrofilic poate fi controlat prin varierea numărului de încărcări ionice pe unitate zaharidică, sau, când zonele ionice sunt baze sau acizi slabi, prin schimbarea pH-ului mediului, care modifică gradele de ionizare. Caracterul hidrofobic poate fi ajustat a) prin legarea covalentă a grupărilor hidrofobice pe lanţul hidrofilic al polizaharidei pentru a da, de exemplu, un polielectrolit alchilat, un aşa numit polisăpun sau b) prin formarea asocierilor dinamice non-stoichiometrice între polizaharide şi un surfactant încărcat opus, pentru a da un complex polielectrolit-surfactant. O atenţie deosebită a fost acordată efectelor concentraţiei, gradului de substituţie, lungimii secvenţei hidrofobe 55 .

Copolimerii bloc sunt sintetizaţi pe două căi:

-Adiţia secvenţială a diferiţilor monomeri în procedee de polimerizare ce conţin centri de reacţie vii.

Polimerizările ionice vii, polimerizările radicalice cu transfer de atom (ATRP), polimerizările cu adiţia reversibilă a transferului de lanţ fragmentat (RAFT), polimerizări cu deschidere de ciclu (ROP), sau combinaţiile lor au fost toate utilizate pentru a obţine copolimeri bloc foarte bine definiţi ai unor compuşi diferiţi.

-Conectarea diferitelor lanţuri polimerice liniare prin funcţiile lor terminale.

Se găsesc în literatură multiple articole referitoare la întrebuințări de succes ale acestei reacții, ce folosesc ca substrat polizaharidele 56 57 , precum și tentative de grefare de lanțuri de policaprolactonă pe polizaharide (doar în cazul celulozei). Dintre proprietăţile polizaharidelor menţionăm capacitatea de a forma filme şi geluri, stabilitatea într-o gamă largă de temperaturi și pH-uri, biocompatibilitate, biodegradabilitate, solubilitate în apă, distribuția moleculară, stereospecificitate și proprietăți funcționale.

Odată cu creşterea numărului de aplicaţii ale polizaharidelor amfifile în tehnologia biomedicală, mai mulţi cercetători s-au concentrat asupra copolimerilor biodegradabili amfifili polizaharidă-poliester.

O strategie în prepararea acestor polizaharide amfifile constă în polimerizarea cu deschidere de ciclu a monomerului (lactida-diesterul ciclic al acidului lactic sau ε-caprolactona) în prezenţa polizaharidei. Această metodă duce la o rată de substituire neomogenă şi la o polidispersitate ridicată datorită gruparilor hidroxil de pe polizaharidă care poate iniţia polimerizarea. În acest caz, un număr mare de lanţuri grefate poliesterice cu lungimi variabile pot forma/duce la mascarea catenei polizaharidei şi modifica proprietaţile ei fizico-chimice.

Acest lucru constituie un dezavantaj major pentru aplicaţiile biomedicale, unde interacţiunile mediului biologic cu suprafeţele polimerice sunt importante pentru bioadeziune, respingerea sterica a proteinelor serice sau orientare. Pentru a preîntampina aceste dezavantaje, o nouă abordare a fost recent adoptată pentru a prepara complexul polizaharida-poliester amfifil, în care lanţurile preformate poliesterice au fost grefate pe catena polizaharidei. Pentru a obţine lanţurile poliesterice, sisteme catalitice bazate pe metal cum sunt octanoatul de staniu şi trietilaluminiu au fost folosite pentru polimerizarea cu deschidere de ciclu a esterilor ciclici. Măsurătorile în stare uscată sunt cele mai folosite şi realizate pe micelele absorbite sau depuse pe un substrat plat solid (mică, grafit, etc) ce au fost anterior uscate. Dimensiunea şi forma micelelor pot fi afectate de efectele de deconvolutie, prin interacţiuni specifice între substrat şi unii compuşi din acesta.

Tehnica microscopiei cu baleiaj (SEM), ca şi AFM-ul oferă doar structura micelară a morfologiei de suprafaţă (structura externă). Combinând TEM, ce furnizează informaţii interne ale micelelor copolimerului, cu SEM (sau AFM) care prezintă morfologia de suprafaţă, se pot obţine informaţii preţioase privind structura micelară a bloc-copolimerilor.

Difractrometria laser (DLS) este o metodă comună de caracterizare, oferind detalii despre morfologia micelară, precum şi o valoare medie a dimensiunii, calculată la un număr mare de micele copolimerice. În plus faţă de această tehnică, difracţia neutronilor (SANS) se foloseşte pentru a elucida structurile micelare. Pentru a genera suficient contrast, măsurătorile SANS sunt în general realizate în solvenţi deuteraţi şi/sau copolimeri bloc parţial deuteraţi. Dezavantajul acestei tehnici constă în necesitatea unui calcul şi în dependenţă de un model. SANS oferă informaţii detaliate atât despre structura micelelor bloc copolimerului cât şi despre interacţiunile inter-micelare. În sistemele dense, această tehnică este folosită pentru a studia termodinamica tranziţiilor de fază dezorganizare-organizare şi detalii despre fazele ordonate. Polimerii cationici amfifili 65 prezintă un progres în ceea ce priveşte vâscozitatea pentru C p foarte redus, datorită predominanţei respingerilor electrostatice în faţa atracţiilor hidrofobe. Această tendinţă este mult mai pronunţată pentru plimerii cu DS ridicat, din cauza unei densităţi ridicate de sarcini, ce majorează respingerile electrostatice (comportament polielectrolitic).

Pentru polimerii amfifili, valorile vâscozităţii reduse se modifică odată cu scăderea lui DS în funcţie de DS şi lungimea R, datorită baleerii între asocieri hidrofobe şi respingeri electrostatice. Polimerii cu DS ridicat prezintă o creştere mică a valorilor vâscozităţii reduse odată cu majorarea concentraţiei polimerice, cauza regăsindu-se în interacţiunile hidrofobe intramoleculare. Pentru un DS mic şi R superior (dodecil şi cetil), se obţine o creştere puternică a ηsp/CP odată cu majorarea lui CP ca rezultat al asocierilor hidrofobe intermoleculare. Procesul de auto-agregare a polielectroliţilor amfifili este studiat folosnd fluorescenţa în stare de regim staţionar, anizotropia şi măsurătorile de vâscozitate.

I.1.2.3. Aplicaţii

S-a analizat vâscozitatea emulsiiilor ulei în apă, cu fracţia volumică a uleilui mai mică de 20%, stabilizate de derivaţi amififilici de dextran 66 . Muller si colab. 67 au studiat dezvoltarea pululanilor amfifili în vederea solubilizării integrale a membranelor proteinelor. Strategia lor a implicat sinteza unui set de derivaţi de pululan amfifil şi compararea performanţelor lor în identifierea acelui polimer ce solubilizează membrana proteinelor cel mai eficient. Modificarea hidrofobică a acestei polizaharide a constat în adiţia de grupări alchil, grefate printr-o legătură esterică, ce este uşor de hidrolizat dacă este necesară eliberarea proteinei. S-a observat, în urma analizelor proteinelor, că legăturile amidice şi esterice nu interferează cu legăturile peptidice. Au fost introduse, de asemenea, şi grupări carboximetilice pentru a asigura solubilitatea în apă a polimerilor modificaţi.

Cele mai intens raportate sisteme polimer/solvent sunt copolimerii bloc nonionici, în special Pluronic-ul, care reprezintă o serie de copolimeri tribloc ce conţin un bloc hidrofilic E şi grupări P sau B hidrofobice, E, P, B fiind poli(oxietilen), poli(oxipropilen), respectiv poli(oxibutilen), într-un amestesc de apă şi solvent organic 68 .

Comportamentul fazic în apă al copolimerilor bloc a fost intens studiat, având în vedere ca majoritatea aplicaţiilor copolimerilor sunt în soluţie apoasă [START_REF] Chu | Nonionic surfactants[END_REF] . Solubilitatea copolimerilor bloc scade invers proporţional cu temperatura şi, peste o anumită valoare a acesteia, are loc separarea de faze [START_REF] Liu | [END_REF]71 . Pentru concentraţii ridicate ale polimerului, încolăcirea lanţurilor polimerice în soluţie conduce la formarea de structuri omogene, imobile, asemănătoare gelurilor.

Prima structură de acest tip este de obicei una cubică, formată printr-o împachetare ordonată a micelelor sferice. Pentru concentraţii polimerice şi mai ridicate, distribuţia regiunilor hidrofile şi hidrofobe conduce la formarea de structuri hexagonale sau lamelare. Structuri cubice bilateral continue au putut, de asemenea, fi observate între regiunile hexagonale şi lamelare [START_REF] Kon-No | Properties and applications of reversed micelles[END_REF] . Pentru micelele în formă de stea, formate de un copolimer bloc într-un solvent selectiv pentru blocul central, este de obicei obţinută o reţea deschisă, fără nici o structură ordonată, pentru concentraţii polimerice mari.

În general, sistemele bloc copolimerice pot oferi mai multe şabloane distincte, la scală nanometrică, precum împachetări cubice tridimensionale de unităţi sferice, împachetări hexagonate bidimensionale de unităţi cilindrice, sisteme lamelare periodice unidimensionale şi morfologii cubice bicontinui tridimensionale. Considerând că lungimea totală a lanţurilor, raportul de lungimi al blocurilor, arhitectura lanţurilor şi compoziţia chimică a copolimerilor bloc sunt toate reglabile, şabloanele pot fi facil ajustate pentru a deservi necesităţi specifice. Uneori, micele cu morfologii diferite (de exemplu, elipse sau bastoane) pot fi totodată obţinute prin selectare unei combinaţii corecte dintre lungimile blocurilor şi calitatea solventului. Prin urmare, nu sunt surprinzătoare aplicaţiile masive a copolimerilor bloc în cadrul proceselor de nanofabricare. Formarea şi stabilizarea veziculelor sau emulsiilor poate fi realizată prin selectarea surfractanţilor sau copolimerilor bloc amfifili corespunzători, în condiţii atent definite.

Anumiţi polimeri speciali, precum dendrimerii sau unele micele copolimerice bloc/grefate modificate, oferă micromedii unice ("nanoreactoare"), ce pot limita creşterea nanoparticulelor în soluţie, astfel încât acestea să fie produse la dimensiuni uniforme 73,74 .

Copolimerii amfifili prezintă caracteristici excelente ca purtători de medicamente cu caracter hidrofob. Părţile interioare hidrofobe ale polimerilor amfifili furnizează o bună acoperire a medicamentelor hidrofobe, în timp ce partea externă hidrofilă este compatibilă cu mediul biologic in vivo. Mai mult, ansamblele de nanoparticule obţinute din polimerii amfifili formează domenii de insule disperse în zonele hidrofilice, ce depozitează medicamentele insolubile în apă şi funcţionează ca bariere înconjuratoare pentru a inhiba activitatea de pierdere a biocomponentelor 75 .

Descoperirea procedeului click chemistry a schimbat într-un mod drastic viziunea comunitaţii ştiinţifice asupra sintezei copolimerilor bloc şi grefaţi 76 .

Numeroşi monomeri ce nu pot fi utilizaţi pentru a produce bloc copolimeri prin intermediul polimerizărilor vii (datorită reactivitaţii extrem de mari a anumitor reactivi sau datorită diferenţelor de solubilitate) se pot acum încorpora cu uşurinţă prin intermediul click chemistry, reacţie care a deschis o usă spre sintezele combinatorice de copolimeri bloc, permiţând obţinerea unor produşi cu proprietaţi unice ce pot fi sintetizaţi repede şi uşor şi cu numeroase aplicaţii în domeniul ştiinţelor farmaceutice 77 .

I.2. REACȚIA CLICK CHEMISTRY I.2.1. Prezentarea reacţiei click chemistry

Principala ţintă în chimia cu aplicaţii în domeniul medical constă în sinteza unor compuși sau clase de compuși reprezentând noi medicamente sau optimizări și, din acest motiv, acest domeniu este în mod particular atras de metode de sinteză ce permit construirea rapidă a moleculelor. Identificarea acestor strategii rapide de sinteză ar trebui să permită chimiei medicale asamblarea unui număr mare de componente biologic active într-o perioadă scurtă de timp, astfel mărindu-se procesul de descoperire și optimizare. Cu toate acestea, alaturi de faptul că trebuie să fie rapide, caracteristicile cheie ale unei sinteze ideale sunt reprezentate de eficiență, versatilitate și selectivitate.

În încercarea de obţine proprietăţi structurale şi funcţionale precum cele ale macromoleculelor naturale, cercetătorii din domeniul ştiinţei materialelor, al polimerilor şi biotehnologiei au fost într-o continuă căutare de strategii de legare bine definite ce pot fi folosite cu eficienţă în prezenţa unui număr mare de grupări funcţionale diferite, întâlnite în special în aceste domenii.

Cerinţele cheie pentru aceste strategii includ: selectivitate ridicată, ortogonalitate pentru alte grupări funcţionale, compatibilitatea cu apă şi alţi solvenţi protici şi, bineînţeles, randamente maxime. Conceptul de "click chemistry" introdus în 2001 de câștigătorul premiului Nobel pentru chimie, Barry Sharpless este in mod indiscutabil unul din cele mai vizibile trenduri în chimia contemporană și se referă la o clasă de transformări chimice care prezintă numeroase caracteristici interesante: domeniu vast de aplicații, randamente ridicate, condiții de reacție simple și performante, o bună selectivitate în condiții experimentale normale, stereospecificitate. 1 În mod general, această reacție constă în utilizarea a două grupări care reacționează împreună într-o manieră specifică, ireversibilă și cu un bun randament. Este o metodă fiabilă ce permite legarea a două elemente distincte prin cuplaj via legături heteroatomice (C-X-C), într-o manieră simplă, eficace și rapidă. Pentru a putea beneficia de calificativul de "click chemistry", o reacție trebuie să satisfacă numeroase criterii și anume: condiții experimentale simple, insensibilitate la prezența oxigenului sau a apei, stereospecificitate, recuperare rapidă a produșilor prin metode ne-cromatografice cum ar fi cristalizarea sau distilarea, randamente foarte bune, precum și un câștig termodinamic în general superior valorii de 20 kcal/mol. Doar patru tipuri de reacții 78 79 80 (Figura 1) sunt considerate că respectă criteriile unei reacții "click chemistry" și anume:

-Reacţii de cicloadiție, cum este cazul cicloadiției 1,3-dipolară Huisgen şi al reacţiei Diels-Alder. -Substituţii nucleofile, în special cele cu deschidere de ciclu, deschideri forţate, electrofile de heterociclu, cum ar fi aziridinele, epoxidele, sulfaţii ciclici, ioni aziridinici, ioni episulfonici, etc. -Chimia carbonilică de tip non-aldol; exemplele includ formarea eterilor, ureelor, tioureelor, hidrazonelor, amidelor, heterociclurilor aromatice, etc. Reacţiile carbonilice de tip aldol au în general forţe termodinamice scăzute, prin urmare au timpi de reacţie mai îndelungaţi şi dau produşi secundari de reacţie, de aceea nu pot fi considerate reacţii click în adevăratul sens al cuvântului. -Reacții de adiție la dublele legături carbon-carbon, cum sunt epoxidările, aziridinările, reacțiile de adiție de tip Michaël. Avantajele acestei noi chimii sunt numeroase, devenind astfel un capitol semnificativ în evoluția materialelor macromoleculare funcționale 81 9 .

Astfel, selectivitatea sa, absența reziduurilor și a produșilor secundari, modularitatea în termeni de temperatură, precum și toleranța sa atât în mediu apos cât și organic, au determinat alegerea acestui tip de reacție pentru îndeplinirea obiectivelor propuse.

Cicloadiția Huisgen 1,3-dipolară

Descoperită în anii 1960 de Huisgen, cicloadiția 1,3-dipolară este exemplul tipic de « click chemistry », satisfacând criteriile enumerate mai sus. Această reacție presupune interacțiunea dintre un compus 1,3-dipolar (azida organică) (Figura 2) și o alchină terminală pentru a forma heterociclul cu 5 membri -triazolii 1, 2, 3 (Figura 3).

2: Natura dipolară a azidei R 1 C C H + N N N R 2 Cu I N N N R 2 R 1 N N N R 2 R 1 + 5 4 1 1 80° C
majoritar minoritar Figura 3: Principiul « Click Chemistry »: formarea triazolilor 1,2,3

Cercetările din ultimii ani au fost în principal consacrate acestei reacţii care concentrează marea majoritate a publicaţiilor pe acest subiect. S-a dovedit a fi atât de eficace, prin faptul că este realizabilă în orice solvent, aici fiind inclusă şi apă, şi prin randamentele sale cantitative în condiţii fiziologice, fiind astfel compatibilă şi cu sistemele vii 82 83 , încât a devenit o alegere atât pentru biologi cât şi pentru organicieni şi biochimişti, făcând din "click chemistry" o adevărată filozofie.

Mecanismul de reacție

Această reacție generează într-o manieră ireversibilă doi izomeri, triazolii 1,4 și 1,5, printr-o abordare anti, respectiv syn. În prezența unui catalizator pe bază de cupru, cu grad de oxidare I, este favorizată obținerea regioizomerului anti 84 . Astfel, această reacție este în mod curent denumită CuAAc (Cicloadiția Azidă-Alchină Catalizată de Cupru(I)).

În 2001, cicloadiția Huisgen 1,3-dipolară a fost primită cu mare interes datorită imensei ameliorări în ceea ce privește regioselectivitatea și eficacitatea catalizatorului Cu(I).

R N 3 R N N N R N N NH 2 R N N N
Sharpless și colab. au propus mecanismul ciclului catalitic al reacției « click » în prezență de Cu(I) (Figura 4). 6,7 În absența catalizatorului Cu(I), reacția este lentă (72 h la 120° C) și de un randament slab (20-40%), cuprul permițând, odată cu alchinele, formarea unui intermediar de tip C≡CCuLn ce accelerează reacția de cicloadiție 85 .

N N N R 2 CuLn R 1 N N N R 2 R 1 CuLn H R 1 CuLn R 1 R 2 N N N R 2 N N N CuLn R 1 N N CuLn N R 1
Ciclul este amorsat de formarea acetilurii de cupru(I) 86 . Calculele teoretice arată că cicloadiția [2+3] (B-direct : I → IV) este defavorizată vis-à-vis de adiția din etapele (B-1 → B-2 → B-3), care se produce printr-un metalociclu intermediar cu șase membri (III).

Alegerea Cu(I) drept catalizator depinde de solventul utilizat în reacție, el însuși ales în funcție de reactivi și de produsul final dorit. În mod general, procentajul de catalizator de Cu(I) utilizat în mediul de reacție se încadrează între 0,2% și 20% molar. Se pot folosi diferite tipuri de săruri de Cu(I) pentru un mediu organic sau apos și utilizarea liganzilor este de cele mai multe ori necesară pentru a stabiliza gradul de oxidare +I al cuprului.

În mediu organic, se poate folosi o bază azotată de tipul Et 3 N (trietilamina), PMDETA (N,N,N",N"-pentametiletilentetramina) sau, cel mai des întâlnită, DIPEA (N,N" diizopropiletilamina) 87 necesară pentru a furniza derivatul acetilură de cupru, implicat în ciclul catalitic.

În mediu hidro-alcoolic, se alege de cele mai multe ori pentru reducerea in situ a CuSO 4 *5H 2 O, ascorbatul de sodiu, sub atmosferă inertă. Avantajul, ce generează de asemenea specii de Cu(I), constă în eliminarea necesității unei baze în sistemul de reacție 88 . Astfel:

-Sub formă de CuX (unde X: Br, I, Cl) solubilitatea constituie o problemă, de exemplu : CuBr este solubil în EtOH, MeOH, DMSO, DMF ; CuI este solubil în CH 3 CN ; CuCl este CuLn insolubil în solvenți polari. Atunci este necesar să se utilizeze o bază (amină terțiară) sau temperaturi ridicate 89 90 91 .

-Sub formă de ligand (de exemplu, Cu(PPh 3 ) 3 Br). Cuprul (I) este stabilizat în prezența aerului și necesită prezența unei baze (amine terțiare) 92 .

Reacția "click chemistry" poate avea loc în solvenți organici, anorganici sau apoși, cum ar sunt:

solvenți protici polari (alcool, apă) 93 solvenți aprotici polari (THF, DMSO, CH 3 CN, DMF, acetonă) 94 95 solvenți nepolari (CCl 4 , hexan, toluen) 15 amestecuri de solvenți: apă/alcool, DMSO/apă, DMF/apă.

Se impune o anumită precauţie atunci când se lucrează cu azide şi derivaţi azidici, deoarece acestia formează compuşi instabili dacă nu sunt manipulaţi cu grijă. Azida de sodiu (NaN 3 ) va forma un compus foarte exploziv (AgN 3 ) în prezenţa sării de argint, iar NaN 3 , într-un mediu acid va da naştere la HN 3 , un gaz toxic.

De asemenea, un raport prea mare de azidă pe un compus organic mic generează compuşi explozivi. În acest context, există o regulă care exprimă raportul de siguranţă între suma totală de carbon şi oxigen împărţită la suma totală de azot, care nu ar trebui să fie mai mică de trei, pentru sinteza monomerilor şi polimerilor funcţionali 96 97 98 99 , a polimerilor bioconjugaţi 100 101 102 şi pentru post functionalizarea polimerilor 8 9 .

Polizaharidele constituie cel mai mare segment al polimerilor disponibili, şi, prin urmare, prezintă cel mai mare potenţial regenerabil, durabil şi biodegradabil în vederea înlocuirii polimerilor sintetici. Faptul că acest potenţial rămâne neexploatat într-o mare măsură este o dovadă a provocărilor inerente din ultimii ani în ceea ce priveste transformarea polizaharidelor din surse naturale, in forme mai potrivite pentru uzul uman.

Una dintre provocările majore în modificarea polizaharidelor constă în depăşirea interacţiunilor non-covalente care caracterizează structurile polizaharidice şi conduc la restricţii semnificative asupra prelucrabilităţii lor. Acestea exercită o influenţă puternică prin restrângerea solubilităţii polizaharidului în solvenţi, limitarea prelucrabilităţii şi dictarea fezabilităţii şi functionalizării polimerului.

I.2.2. Aplicații ale reacției "click chemistry" în domeniul polizaharidelor

Nu există numeroase referinţe în ceea ce priveşte modificarea chimică a polizaharidelor prin "click chemistry". Primul caz de grefare a unui polimer pe catenă principală polizaharidică a fost descris recent de Makuska şi colab. 103 şi anume, sinteza structurilor de tip pieptene, compusă din scheletul de chitosan şi de grefele laterale de PEG.

În 2006, Shinkai şi colab. 104 au fost primii care au utilizat această reacţie pentru grefarea moleculelor mici pe lanţurile de (1-3)-β-D-glucan, în vederea obţinerii unor derivaţi cu diferite module funcţionale, ce s-au dovedit utili în transportul de gene. Ca mediu de reacţie s-a folosit DMSO şi N-metilpirolidona (NMP) la 25°C timp de 12h în prezenţa CuBr 2 , propilaminei şi ascorbatului de Na. Conversia reacţiei de grefare variază între 68 şi 73% în funcţie de molecula grefată.

În acelaşi an, Heinze si colab. 105 au realizat cercetări de aceeaşi natură pe lanţurile de 6azido-6-celuloză pentru a sintetiza un nou polielectrolit, ce va prezenta heterocicluri care conţin sulf sau azot şi care vor prezenta activitate biologică, clasându-se printre cele mai promiţătoare medicamente cu activitate anti-HIV şi antitumorală. Reacţiile au avut loc în DMSO la 25°C şi la 70°C timp de 24 h în prezenţa CuSO 4 *5H 2 O şi a ascorbatului de Na. Randamentele sunt cantitative pentru cele 2 temperaturi, ceea ce demonstrează eficacitatea reacţiei "click chemistry" la temperatura ambiantă (Figura 5).

Figura 5. Grefarea de molecule simple pe derivaţi de celuloză 31 .

Hotha 106 a realizat cicloadiţia Huisgen între alchinil şi azidoetil glicozidă, în prezenţa CuI, pentru a obţine oligozaharide hetero şi homo dimerice ce au 1,2,3-triazole. Autorii au anticipat că aceste cicluri triazolice pot avea o varietate de bioactivităţi, de la antibacteriene la anti-HIV (Figura 6). Figura 6. Sinteza pseudo-oligozaharidelor prin click chemistry.

Un an mai târziu, Shinkai şi colab. 107 au deschis calea vectorizării de molecule nonhidrosolubile în mediu apos la pH neutru prin faptul că macromoleculele obţinute posedă o conformaţie elicoidală în apă şi sunt capabile de a complexa anumite molecule hidrofobe. Pentru aceasta, ei au introdus grupări de tip amoniu cuaternar pe lanţurile de β- (1,3) glucan. Polizaharida a fost functionalizată anterior la OH-ul din poziţia C6 (prin prepararea unui intermediar bromurat cu CBr 4 în DMF apoi reacţia cu o sare de LiN 3 ), urmată de reacţia cu clorură 3-trimetil amoniu-1-cationic. Conversia este totală în 24h.

În 2008, Vasella şi colab. 108 au lucrat pe derivaţii azidici ai celulozei grefând lanţuri alchil de talie crescândă (de la 1 la 8 atomi de C) şi terminate cu funcţie alchină. Reacţia a avut loc în DMSO la cald timp de 2-3 zile. Grefarea este cantitativă, dar rezultatul nu este surprinzător ţinând cont de timpul de reacţie şi de temperatura utilizată (între 60 şi 100 °C).

Echipa coordonată de Heinze a descris recent sinteza derivaţilor celulozici ce au radicali laterali dendrimerici ataşaţi la un lanţ de celuloză printr-un ciclu triazolic. Au fost utilizate mai multe strategii de sinteză, cu functionalizarea lanţului celulozei. Acesta poate fi functionalizat cu grupări azidice 109 în urma substituirii cu un halogen cu grupări alchinice, folosind ca intermediar texidimetilsilan 110 sau tosilat 111 .

În 2009 Li 112 a raportat pentru prima dată administrarea orală a nanoparticulelor chitosan-ADN deschizând astfel calea vectorizării în domeniul terapiei genice. Produşii pe bază de chitosan au manifestat o legare puternică de ADN şi o protecţie crescută a acestuia împotriva degradării nucleazelor.

Modificarea polizaharidelor prin "click chemistry" în soluţie s-a dovedit eficace şi cantitativă în toate lucrările. Până acum, câteva cazuri au arătat că această strategie de sinteză este posibilă şi în mediu eterogen. Hafrén şi colab. 113 au demonstrat pentru prima dată că suprafeţele solide polizaharidice pot fi modificate printr-o combinaţie de organocataliză şi click chemistry într-un mediu de reacţie eterogen, la temperatura ambiantă. Astfel, a fost obţinut un compus celulozic solid foarte fluorescent prin modificarea celulozei prin reacţii de esterificare cu un acid carboxilic purtător de funcţii alchinice, acidul 5-hexanoic. Apoi, reacţia click a fost realizată cu un derivat azidic al cumarinului, în faza eterogenă, la temperatura ambiantă. Formarea ciclulurilor triazolice a fost pusă în evidenţă prin fluorescenta datorită grupărilor cumarinice. Autorii nu au dat nici o indicaţie asupra gradului de conversie. O abordare similară a fost raportată de Bras şi colab. 114 care au modificat fibre de celuloză prin grefarea de lanţuri de poli (ε-caprolactona) în faza eterogenă, în THF, la temperatura ambiantă. Eficacitatea reacţiei nu a fost cuantificată, dar împreună cu cele de mai sus dovedeşte fezabilitatea reacţiei "click chemistry" în ceea ce priveşte modificarea chimică a polizaharidelor, chiar şi în mediu eterogen.

În ceea ce priveşte reticularea lanţurilor polizaharidice, doar câteva referinţe sunt menţionate. Hilborn şi colab. 115 au obţinut primul exemplu de hidrogel preparat folosind CuAAC, pornind de la poli (vinil alcool)(PVA) cu o greutate moleculară medie de 16000, funcţonalizat fie cu o alchină fie cu o azidă printr-o reacţie în doi paşi ce implică drept intermediari carbonildiimidazolele. Hidrogelurile obţinute prin "click chemistry" au prezentat capacităţi de umflare mult mai mari şi proprietăţi mecanice îmbunătăţite comparativ cu hidrogelurile obţinute prin metodele cunoscute până în prezent.

Crescenzi şi colab. 116 au reacţionat la temperatura camerei, în apă, lanţuri de hialuronat de sodiu funcţionalizat cu grupări azidice, cu altele purtătoare de funcţii alchinice laterale.

Formarea unei reţele chimice a fost confirmată prin analiza RMN 1 H HR-MAS şi prin măsurători reologice. Gelurile obţinute au fost supuse investigării în vederea eliberării controlate a biomoleculelor relevante terapeutic precum şi pentru matrici de celule pentru ingineria tisulară, autorii demonstrând că reţelele hialuronice nu numai că au făcut posibilă eliberarea controlată în mod eficient a doxorubicinei dar şi înglobarea celulelor de cultură, 60% din aceste celule prezentând activitate proliferativă după construcţia scheletului hidrogelului prin metoda click.

Zhang şi colab. 117 au elaborat reţele pe bază de derivaţi azidici multifuncţionali de celuloză şi de lanţuri de poli-isopropilacrilamidă cu grupări alchinice. În amândouă cazurile, timpul de gelifiere este de câteva minute, ceea ce arată rapiditatea reacţiei "click chemistry" la temperatura ambiantă.

Hidrogeluri termosensibile pe bază de guar au fost obţinute în soluţii apoase de către Tizotti 118 şi colab. între guaruri functionalizate cu grupări alchinice şi α,ω-diazidopoli(etilenglicol)-co-(propilen glicol).

Ringot 119 descrie în articolul său obţinerea unei ţesături de bumbac antibacterian obţinută prin "click chemistry" prin grefarea unui derivat de porfirină pe celuloză modificată chimic. Materialul nou a fost capabil să ucidă bacteriile Gram-negative şi Gram-pozitive, cum ar fi E. coli şi S. Aureus, dovedindu-și utilitatea în domenii care ar beneficia de dezinfecţie de suprafaţă, permanent şi eficient.

În 2009, Heinze 120 a raportat sinteza unor derivaţi deoxi-azido celulozici, solubili în apă, obţinuţi în urma carboximetilarii eterogene, într-un mediu alcătuit din 2-propanol/soluţie apoasă de NaOH.Acest compus este de fapt un material de plecare pentru funcţionalizarea cu dendroni de propargil-poliamidoamină via click chemistry (Figura 7).

I.3. Hidrogeluri pe bază de polizaharide cu hidrofilie redusă .3.1. Metode de obţinere a hidrogelurilor pe bază de polizaharide

Hidrogelurile reprezintă o clasă de materiale polimerice care dispun de abilitatea de a reţine o cantitate substanţială de apă, prezentând o consistenţă "moale şi cauciucată" şi o tensiune interfacială redusă. Aspectul structural al acestor materiale domină prin proprităţile lor de suprafaţă, permeselectivitatea şi permeabilitatea, ceea ce conferă hidrogelurilor proprietăţi unice şi interesante, dar şi similaritatea caracteristicilor lor fizice cu cele ale ţesuturilor vii. Hidrogelurile sunt materiale cu potenţial aplicativ în sfera aplicaţiilor biomedicale, având în vedere că prezintă avantaje faţă de alte biomateriale polimerice. Natura structurii hidrogelurilor, datorită conţinutului lor ridicat de apă, permite extragerea produşilor de reacţie secundari nedoriţi, înainte de implantare, respectiv fluxul de lichide corporale dintre ţesut şi implantul in vivo. Posibilitatea de fabricare sub variate forme geometrice şi alterarea facilă a formei fizice permit ajustarea proprietăţilor fizice, conform specificului unei aplicaţii. În general, caracteristicile fizice ale hidrogelurilor sunt determinate de către metodele de sinteză, respectiv de către parametri.

Hidrogelurile transparente din punct de vedere optic, în forma lor densă, sunt utilizate pentru lentile de contact moi, în timp ce hidrogelurile poroase îşi găsesc aplicaţii ca biometerial spongios, precum o grefă sintetică pentru repararea ţesuturilor cartilaginoase, osoase şi nu numai [8][9][10][11] . Pentru a îmbunătăţi fixarea grefelor în locaţia de implant, creşterea ţesutului se doreşte a fi direcţionată către interiorul structurii din hidrogel poros. Prin urmare, porii materialului trebuie să fie interconectaţi şi suficient de mari pentru a permite invazia de celule şi vascularizarea ţesutul nou format 9,12 122 . Abilitatea hidrogelurilor de a absorbi apă se datorează prezenţei grupurilor hidrofile precum -OH, -CONH-, -CONH 2 , -COOH, şi -SO 3 H 123 . Conţinutul în apă al acestora influenţează diferite proprietăţi, precum permeabilitatea, caracteristicile mecanice şi de suprafaţă, respectiv biocompatibilitatea. Hidrogelurile prezintă proprietăţi fizice similare ţesutului viu, această similaritate datorându-se volumului ridicat de apă înglobat, consistenţei moi -cauciucate şi tensiunii interfaciale reduse cu apa sau fluide biologice. Posibilitatea moleculelor de dimensiuni diferite de a difuza în (încărcare de medicament) şi din (eliberarea de medicament) hidrogeluri permite utilizarea acestora ca sisteme de eliberare. Având în vedere că hidrogelurile au o permeabilitate ridicată pentru medicamentele solubile în apă şi pentru proteine, cel mai întâlnit mecanism de eliberare medicamentoasă, aferent sistemului hidrogel, este difuzia.

Hidrogelurile sunt cel mai intens utilizate în eliberarea controlată a agenţilor bioactivi şi pentru încapsularea de celule şi biomolecule. În multe dintre aceste cazuri, structura tridimensională a hidrogelurilor trebuie să se dezintegreze în produţi netoxici nepericuloşi, pentru a asigura biocompatibilitatea gelului. Natura produşilor de degradare poate fi configurară printr-o selecţie corespunzătoare a elementelor de bază ale hidrogelului. Având în vedere acest considerent, sunt utilizate în prezent multiple şi variate metode 124 de reticulare chimice şi fizice pentru proiectarea hidrogelurilor biocompatibile.

Gelurile reticulate chimic sunt destul de stabile din punct de vedere mecanic, datorită legăturilor ionice şi covalente ce le caracterizează. Cu toate acestea, adăugarea unui agent de reticulare conduce la efecte adverse dacă acest compus este toxic, care, odată eliberat în corp, devine destul de nociv. Metodele de reticulare chimică sunt următoarele:

-Polimerizarea radicală a monomerilor cu masă moleculară redusă, sau a homopolimerilor ramificaţi, respectiv a copolimerilor, în prezenţa unui agent de reticulare. Această reacţie este cel mai adesea efectuată în soluţie pentru aplicaţii biomedicale. Majoritatea polimerilor hidrofili dispun de grupări hidroxilice, precum aldehidele, acidul maleic şi oxalic, dimetilurea, diisocianatele etc., care condensează în cazul aplicării grupurilor hidroxile organice ca agenţi de reticulare. Solventul utilizat pentru aceste reacţii este îm mod normal apa, dar metanolul, etanolul şi ancoolul benzilic au fost de asemenea folosite. Aceşti solvenţi pot fi implicaţi doar dacă după formarea structurii de reţea, solventul poate fi înlocuit cu apă. Figura 1 prezintă o schemă de reacţie tipică acestui tip de reticulare : Figura 1. Schemă de reacţie tipică structurii reticulate de tip Flory 125 .

Reacţiile de reticulare pot de asemenea avea loc în absenţa agenţilor de reticulare, dacă poate fi aplicat un iniţiator tip radical liber, care să formeze radicali liber în lanţul principal.

-Reacţiile de copolimerizare sunt utilizate în producţia gelurilor polimerice. Sunt produse în acest mod multiple hidrogeluri, precum poli(hidroxialchil metilacrilatele). Iniţiatorii folosiţi în cadrul acestor reacţii sunt de tip radical şi anionic, printre care: azoisobutironitrilul (AIBN), peroxidul de benzoil etc. Solivenţii pot fi adăugaţi pe parcursul reacţiei, pentru a reduce vâscozitatea soluţiei.

Mecanismul cinetic

Mecanismul de reticulare este compus din patru paşi: iniţiere, propagare, reticulare şi finalizare. Finalizarea pot avea loc prin combinare, dispoporţionare şi tranfer de lanţuri către monomer. Un exemplu de reacţie reprezentativă este următorul 4 :

Iniţiere:

Propagare şi reticulare: Finalizare prin combinare: Finalizare prin disproporţionare:

Transfer lanţ către monomer:

Reticularea prin radiaţie cu energie ridicată

Radiaţia cu energie ridicată, precum cea de tip gamma 126 sau din fascicule de electroni, poate fi aplicată la polimerizarea compuşilor nesaturaţi. Polimerii solubili în apă, derivaţi cu grupări vinil, pot fi convertiţi în hidrogeluri utilizând radiaţie cu energie ridicată. Spre exemplu, PEG derivat în PEGDA poate forma hidrogeluri în cazul iradierii UV (ultra-violet). Polimerii ce nu dispun de grupări vinil adiţionale pot fi de asemenea reticulaţi folosind radiaţii. La expunerea la radiaţie gamma sau cu fascicul de electroni, soluţiile polimerice apoase formează radicali pe lanţurile polimerice (spre exemplu, prin ruperea hemolitică a legăturilor C-H).

În plus, radierea moleculelor de apă determină formarea de grupări hidroxile, ce pot ataca lanţurile polimerice, ducând la formarea de microradicali. Recombinarea acestor microradicali pe diferite lanţuri conduce la formarea de legături covalente şi, în final, la o structură reticulată.

Caracteristicile de umflare şi permiabilitate ale gelului depind de nivelul de polimerizare, o funcţie de dozaj între polimer şi radiaţie (în general, densitatea de reticulare creşte odată cu doza de radiaţie).

Avantajul aplicării acestui proces în formarea de geluri se regăseşte în faptul că poate fi realizat în apă, în condiţii blânde, fără necesitatea pentru un agent pentru reticulare. Există totuşi şi neajusuri: materialul bioactiv trebuie încărcat după formarea gelului, deoarece iradierea ar putea deteriora agentul. De asemenea, în cazul gelurilor precum PEG şi PVA, reticulările sunt constituite din legături C-C, care nu sunt biodegradabile.

Reticularea folosind enzime

A fost publicată recent o nouă metodă 127 , ce foloseşte o enzimă pentru sintetizarea hidrogelurilor pe bază de PEG. Tetrahidroxi PEG a fost funcţionalizat prin adăugarea de grupări glutamil, formându-se reţele prin adaos de transglutaminază în soluţia de PEG şi poli(lizinăcofenilalanină). Această enzimă a catalizat reacţia dintre gruparea γ-carboxamidă de PEG şi gruparea ε-amină de lizină, pentru a obţine o legătura amidă între polimeri. Proprietăţile gelului pot fi modelate prin modificarea proporţiilor de PEG şi lizină.

Gelurile reticulate chimic implică utilizarea unui agent de reticulare, care este adesea toxic. Această acţiune solicită eliminarea agentului de reticulare din gel, ceea ce poate afecta integritatea gelului.

Din aceste motive, variantele reticulate fizic devin din ce în ce mai importante, dizolvarea fiind prevenită datorită interacţiunilor fizice dintre lanţurile polimerice. Au fost cercetate mai multe metode, explorându-se prepararea gelurilor reticulate fizic. Cele mai utilizate medode şi domeniilor lor de aplicare sunt:

Reticularea prin interacţiuni ionice

Un exemplu de reticulare prin interacţiuni ionice este cea a alginatului. Acesta conţine reziduuri de acid glucuronic şi manuronic şi poate fi reticulat folosind calciumioni. Reticularea poate fi realizată pentru valori normale ale temperaturii şi pH-ului. Gelurile obţinute sunt folosite ca matrici pentru încapsulare de celule ţi pentru eliberare de proteine. În plus, hidrogelurile bazate pe chitosan, precum şi pe dextran, reticulate cu ioni de potasiu, reprezintă alte geluri sintetizate prin interacţiuni ionice. Pe lângă reticularea polimerilor anionici cu ioni metalici, hidrogelurile pot fi de asemenea obţinute prin complexarea polianionilor şi policationilor.

Reticularea prin cristalizare

O soluţie apoasă de PVA, trecută printr-un proces de îngheţare-dezgheţare, conduce la un gel rezistent şi foarte elastic. Formarea gelului este atribuită obţinerii de cristale de PVA, ce se comportă ca zone de reticulare fizică în cadrul reţelei. Proprietăţile gelului pot fi modificate prin varierea concentraţiei polimerului, a temperaturii şi a duratelor ciclurilor de îngheţare şi dezgheţare. A fost demonstrată utilitatea acestor geluri în eliberarea de medicamente 128 .

Reticularea prin legături de hidrogen

Acidul poliacrilic şi cel polimetacrilic formează complexuri cu poli(etilen glicol), prin legături de hidrogen între oxigenul din poli(etilen glicol) şi gruparea acidă carboxilică a acidului polimetacrilic 129 . De asemenea, au fost observate legături de hidrogen în acid polimetacrilic-getilen-glicol. Aceste legături se formează doar atunci când sunt protonate grupările de acid carboxilic. Rezultă că umflarea gelurilor este dependentă de pH. A fost recent dezvoltat un sistem de hidrogel folosind principiile hibridizării ADN prin legături de hidrogen 130 . În cadrul acestei metode, au fost cuplate oligodeoxiribonucleotide la o un polimer solubil în apă. Au fost preparate hidrogeluri prin adăugarea unei oligodinucleotide (ODN), fie conjutate aceluiaşi polimer solubil în apă, fie în forma sa liberă, la o soluţie apoasă de copolimer derivat ODN, solubil în apă.

Reticularea prin interacţiuni proteice

Ingineria genetică a fost de asemenea utilizată la prepararea de hidrogeluri. Principalul avantaj constă în faptul că secvenţa de peptide şi, prin urmare, proprietăţile ei fizice şi chimice, pot fi controlate precis prin proiecterea corectă a codului genetic aferent secvenţelor de ADN sintetic 131 . Capello şi colab. au constituit copolimeri bloc secvenţiali, ce conţin o repetiţie de blocuri similare mătăsii, respectiv elastinei, în cadrul căreia blocurile insolubile de segmente gen mătase sunt asociate sub formă de fibre sau pături beta aliniate, cu legături de hidrogen. Aceste hidrogeluri pot fi utilizate pentru eliberarea de medicamente, influenţată de concentraţie, compoziţie a polimerului şi temperatură. Reticularea prin interacţiuni antigen-anticorp a fost de asemenea realizată: un antigen (IgG de la iepuri) a fost grefat pe o poliarilaidă reticulată chimic, în prezenţa unui reticulator adiţional. Mai mult, hidrogelurile au fost obţinute prin imobilizarea atât a antigenului cât şi a anticorpului, sub forma unei reţele polimerice interpenetrante. Această metodă poate permite eliberarea medicamentoasă ca răspuns la un antigen specific.

I.3.2. Metode de caracterizare a hidrogelurilor pe bază de polizaharide

Caracterizarea hidrogelurilor presupune în primul rând, verificarea solubilității lor, proprietate ce se verifică prin două metode.

Metoda A.

În mod curent, conținutul de hidrogel dintr-un material este estimat prin măsurarea părții sale insolubile dntr-o probă uscată după imersarea sa în apă distilată timp de 16 132 unde C este greutatea hidrogelului obținut după uscare și B este greutatea părții insolubile după spălarea cu apă.

FT-IR este o tehnică folositoare pentru identificarea structurii chimice a unei substanțe.Se bazează pe faptul că componentele de bază ale unei sbstanțe (ex. legăturile chimice) pot fi excitate și astfel ele pot absorbi lumină infraroșie la frecvențe ce sunt specifice pentru anumite tipuri de legături chimice. Această tehnică este frecvent folosită pentru a investiga aranjarea structurală 135 din hidrogeluri prin comparație cu materielele de plecare.

Microscopia electronică de baleiaj

SEM-ul este utilizat pentru informațiile ce le oferă despre topografia suprafeței probei, fiind cea mai des tehnică utilizată pentru a capta structura rețelei caracteristice din hidrogeluri.

Difracția dinamică a luminii

Cromatografia pe gel cuplată cu un aparat de difracție dinamică multiplă a luminii (GPC MALLS) este o tehnică utilizată pentru determinarea distribuției moleculare și a parametrilor unui sistem polimeric. Această investigație este folosită în cuantificarea hidrogelurilor din sistemele polimerice, cum sunt câteva hidrocoloide, guma arabică, gelatina și pululanul 136 .

Analiza sol-gel

Pentru reticularea cu radiații, analiza sol-gel este o metodă de caracterizare importantă deoarece permite estimarea parametrilor cum ar fi randamentul de reticulare și degradare, doza de gelație, etc. și de a corela acestea cu anumite proprietăți fizico-chimice. Relația fracției sol și doza absorbită conform ecuației Charlesby-Pinner este dată în ecuația de mai jos, ecuație frecvent folosită pentru polimerii liniari cum e cazul carboximetil celulozei 137 s+ = + ecuația (5) unde s este fracția sol, p 0 reprezintă densitatea de degradare, numărul mediu de scindări ale lanțului principal pe unitate monomerică și pe unitate de doză, q 0 reprezintă densitatea de reticlare, proporția de unități monomerice reticulate pe unitate de doză, μ2,0 este greutatea medie inițială a gradului de polimerizare și D reprezintă doza de radiație în G y .

Reologia

Proprietățile reologice sunt dependente de tipul structurii (ex. asociere, reticulare) prezente în sistem. Soluțiile polimerice sunt vâscoase la frecvențe joase, cu tendința de a urma legea G" ~ ω 2 și G""~ ω. La frecvențe înalte, domină elasticitatea (G" > G""). Aceasta corespunde comportamentului de tip Maxwell cu un singur timp de relaxare ce poate fi determinat de la punctul de joncțiune și timpul de relaxare crește cu concentrația.

Caracterizarea mecanică

În prezent, cea mai folosită metodă în determinarea proprietăților mecanice ale hidrogelurilor este cea a rezistenței la întindere ce presupune aplicarea unei forțe pe fâșii de material imobilizate între două cleme.

Forța aplicată și elongația materialului sunt folosite pentru a obține un grafic al deformării forțelor, grafic ce se folosește pentru a obține câteva proprietăți mecanice ale hidrogelului cum ar fi modulul lui Young, limita de curgere,rezistența la întindere.

Alte tehnici

Metodele principale folosite pentru a caracteriza și a cuantifica cantitatea de apă liberă și legată din hidrogeluri constau în DSC și RMN. Protonul RMN furnizează informații despre schimbul de molecule de apă dintre stările numite libere și legate. Folosirea DSC se bazează pe presupunerea că doar apa liberă poate fi înghețată, astfel încât se presupune că endoterma măsurată la încălzirea gelurilor înghețate reprezintă topirea apei libere și că valoarea sa va conduce la aflarea cantității de apă liberă din hidrogeleul testat.

I.3.3. Metode de hidrofobizare a hidrogelurilor pe bază de polizaharide

Pentru aplicaţii ne-biodegradabile, este esenţial ca matricea gelului purtător să-şi menţină integritatea fizică şi mecanică. Stabilitatea mecanică a gelului este, prin urmare, un aspect important în proiectarea unui sistem terapeutic. Spre exemplu, medicamentele şi alte biomolecule trebuie protejate de mediile dăunătoare din corp, precum pH-ul extrem dinaintea eliberării în locaţia ţintă. Pentru aceasta, gelul purtător trebuie să aibă capacitatea de a-şi menţine integritatea fizică şi rezistenţa mecanică, pentru a se dovedi un biomaterial eficient. Rezistenţa materialului poate fi majorată prin încorporarea agenţilor de reticulare şi comonomerilor, respectiv prin creşterea gradului de reticulare. Există totuşi un grad optim de reticulare, având în vedere ca o valoare prea mare a acestuia poate conduce la fragilitate şi o elasticitate redusă.

Elasticitatea gelului este importantă în conferirea de flexibilitate lanţurilor reticulate, pentru a facilita mişcarea agentului bioactiv încorporat. Este deci necesar un compromis între rezistenţa mecanică şi flexibilitate, pentru utilizarea corespunzătoare a acestor materiale.

I.3.4. Aplicaţii ale hidrogelurilor pe bază de polizaharide cu hidrofilie redusă

Hidrogelurile au fost intens studiate ca biomateriale pentru o gamă extinsă de aplicaţii, datorită similarităţilor lor structurale cu ţesuturile din corp. Spre exemplu, sistemele de eliberare de medicamente bazate pe hidrogeluri prezintă un interes ridicat deoarece pot fi uşor modificate pentru a-şi adapta caracteristicile şi pot conduce la livrare direcţionată, extinderea timpului de circulaţie şi la reducerea toxicităţii şi efectelor secundare. Moleculele de medicament sunt incluse fizic în reţea şi eliberate din matricea hidrogelului prin difuzie, care poate fi ajustată prin modificarea conformaţiei reţelei şi/sau a afinităţii acesteia pentru medicament. Mai mult, hidrogelurile pot fi un excelent purtător nu doar pentru molecule mici, dar şi pentru macromolecule bioactive fragile, precum proteinele. Faptul că hidrogelurile conţin cantităţi ridicate de apă în reţeaua polimerică permite constrângerea activităţii proteinelor în reţeaua polimerică protectivă şi previne denaturarea acestora, ceea ce transformă hidrogelurile în materialele ideale pentru stocarea şi eliberarea de proteine.

Cu toate acestea, hidrogelurile curente, ca instrumente de livrare a medicamentelor, sunt limitate de către natura lor hidrofilă, care nu permite utilizarea lor sub formă de sisteme de eliberare pentru medicamentele hidrofobe, din cauza unei eliberări rapide în faza iniţială. În plus, din cauza interacţiunilor hidrofobe, se pot forma agregate de medicamente de mari dimensiuni pe parcursul procesului de încărcare a medicamentului, ceea ce poate conduce la o concentraţie locală ridicată şi cauza efecte secundare sau chiar toxicitate.

Gelurile formate prin reticularea polizaharidelor ce prezintă grupări carboxilice, sunt cunoscute şi folosite de mulţi ani, în domeniile stomotologiei şi tehnologiilor de preparare a mâncării. Dintre aceste geluri, cele mai întâlnite sunt compuse din alginate insolubile în apă care includ, cu excepţia magneziului şi a sărurilor metalice alcaline, grupa a doua de săruri metalice de acid alginic.

Aceste geluri alginate insolubile în apă sunt formate în mod tipic prin conversia chimică a alginatelor solubile în apă, într-o soluţie apoasă, în alginate insolubile în apă. Această conversie este de obicei realizată prin reacţia dintre alginata solubilă în apă şi cationii polivalenţi eliberaţi dintr-o sare metalică di-sau trivalentă solubilă.

Hidrogelurile pe bază de polizaharide insolubile în apă şi încărcate cu medicament prezintă atât o utilitate particulară în pregătirea preoperativă a cavităţilor vaginale şi/sau rectale pentru obţinerea unui mediu aseptic, cât şi aplicabilitate ca dispozitive de eliberarea de medicamente pentru orice cavitate sau suprafaţă a corpului. Spre exemplu, pot fi folosite ca pansamente, medicamente cu eliberare susţinută sau contraceptive vaginale 138 . Hidrogelul medicamentos poate conferi o eliberare prelungită a medicamentului în cavitatea corporală, pentru până la 24 de ore sau chiar mai mult și de asemenea este capabil de a absorbi exudaţi din cavitatea corporală, fără o umflare considerabilă. Rămâne umed, reducând prin urmare traumele şi iritaţiile ţesutului înconjurător, dar menţine suficientă integritate structurală pentru a fi eliminat întreg din cavitatea corporală, chiar şi saturat cu lichide corporale sau alte lichide apoase.

Hidrogelurile au cunoscut o dezvoltare extraordinară în ceea ce priveşte încapsularea de celule şi eliberarea controlată a agenţilor terapeutici dispuşi în interiorul lor. O mare atenţie a ofst acordată gelurilor compuse din polizaharidepolimeri biologici, regăsiţi în numeroase tipuri de ţesuturi şi organisme şi care sunt capabili de a fi reticulaţi în hidrogeluri care încapsulează agenţi activi (de exemplu, factori de creştere şi alte macromolecule) sau celule pentru eliberare ori incubare, prin intermediul degradării hidrogelului pentru eliberarea agentului sau celulei încapsulate. Totuşi, aceste hidrogeluri se degradează în mod tipic doar în prezenţa enzimelor care descompun scheletul polizaharidei. Prin urmare, există o necesitate pentru compoziţii biocompatibile care se degradează în prezenţa unui mediu apos, de exemplu apa, astfel încât să elibereze un agent activ dispus în interiorul hidrogelului. Aceste hidrogeluri pot fi proiectate astfel încât să se degradeze pe parcursul mai multor zile sau chiar luni.

Pe parcursul ultimilor ani, hidrogelurile au fost de asemenea utilizate ca imitatori de matrici extracelulare tridimensionale, pentru a elimina limitările condiţiilor culturilor celulare bidimensionale tradiţionale. Hidrogelurile precum matrigelul şi colagenul, care sunt bazate pe polimeri naturali, au fost cercetate extensiv pentru aplicaţii în domeniul culturilor celulare tridimensionale. Cu toate că au fost obţinute rezultate promiţătoare din prisma celulelor crescute cu aceste geluri naturale, din cauza compoziţiei lor complexe, variabile şi insuficient de clar definite, nu a putut fi obţinută a cultură celulară precis controlată. Pe de altă parte, hidrogeluri sintetice cu reţele şi rezistenţă mecanică bine definite pot constitui platforme tridimensionale stabile pentru creşterea de celule, dar căreia îi lipsesc semnalele biologice care pot realiza comunicarea cu alte celule şi controla comportamentul acestora. Prin urmare, sunt cercetate hidrogelurile sintetice conjugate cu diferite molecule biologice cu semnal, pentru a înlocui gelurile naturale.

Numeroase studii abordează hidrogelurile pe bază de pululan, ca sisteme de eliberare medicamentoasă, în mod particular sub formă de microgeluri şi nanogeluri. Se pot obţine rezultate terapeutice evidente prin eliberarea lentă a medicamentelor în plasmă, modificând astfel profilele concentraţiei medicamentelor 139 .

Au fost pregătite nanoparticule de hidrogel din pululan reticulat cu glutaraldehidă, pentru a dezvolta sistem purtător de ADN, potenţând astfel eficienţa de încărcare a genelor, proprietăţile de eliberare controlată, biocompatibilitatea şi stabilitatea 140 . În particular, pululanii amfifili obţinuţi din grefe colesterile, acetile şi cloroacetile pe grupări hidroxile, formează nanogeluri capabile de a intrapola molecule hidrofobe, proteine sau peptide şi acizi nucleici. Mai mult, nanogelurile hidrofobizate bazate pe pululan interacţionează cu totodată cu variate ansambluri moleculare, precum lipozomii şi emulsiile apă-ulei 141 . Prin urmare, conjugatele hidrofobizate pe bază de pululan au fost utilizate ca purtători de medicamente direcţionaţi, pentru substanţe bioactive, precum metronidazol, acid nicotinic, sulfatiazol, mitoxantronă sau epirubicină, pentru legarea lor de variate substanţe hidrofobe şi proteine solubile, precum şi în biotehnologie, ca însoţitori în prezenţa β-ciclodextrinei sau pentru formarea de nanogeluri hibride.

Pot fi folosite ca nanopurtători polimerici în stabilizarea proteică pentru chimioterapia în caz de cancer şi pentru vaccinuri artificiale. Nanogeluri ce răspund la stimuli, precum cele sensibile la pH, temperatură şi lumină, au fost de asemenea proiectate, folosind o metodă de auto-asamblare similară 142 . Majoritatea studiilor importante din domeniul pululanului hidrofobizat raportează asupra auto-asamblării pululanului purtător de colesteril în nanoparticule stabile de hidrogel, în cadrul cărora lanţurile de pululan au fost reticulate ne-covalent prin asocierea compuşilor pe bază de colesteril, ca în figura următoare: Amiloza este un α -glucan relativ lung, liniar, cu o masă moleculară MW= 100,000-500,000, ce conține aproximativ 99% de lanțuri (1 -4)-α-și (1 -6)-α și diferă în mărime și structură depinzând de originea botanică. Amiloza are o masă moleculară de aproximativ 1 x 10 5 -1 x 10 6 .

Amilopectina este o moleculă mult mai mare ca amiloza, cu o masă moleculară de 1 x 10 7 -1x 10 9 și o structură foarte ramificată alcătuită din aproximativ 95% lanțuri (1 -4)-α și 5% (1 -6)-α. Ramificările amilopectinei conțin în jur de 20-25 unități glicozidice. Lanțurile unității de amilopectină sunt relativ scurte comparativ cu moleculele de amiloză, având un profil de distribuție larg. 144 . Prezenţa punctelor de ramificaţie din amilopectină permite lanţurilor scurte liniare să se grupeze împreună într-un mod eficient sub formă de dublu helix paralel, formând astfel baza granulelor de amidon semicristaline 145 . În mod contrar, amiloza formează cea mai mare parte din regiunile amorfe, ce sunt distribuite aleator între clusterele de amilopectină. Regiunile de ramificare se constituie din stratul amorf ce separă cristalitele între ele.

Umflarea în apă a granulelor de amidon pur reprezintă un proces reversibil la temperaturi sub cea de gelatinizare, datorită structurii stabile semi-cristaline. Absorbţia de apă este în mod normal mai mică de 40%. Atunci când este majorată temperatura unei suspensii de granule de amidon cu exces de apă către valoarea de gelatinizare, granula de amidon îşi va pierde caracteristicile de birefringenţă şi cristalinitate, în paralel cu umflarea. Această modificare este ireversibilă şi se numeşte "gelatinizare". Gelatinizarea completă are loc în mod normal pentru un interval de temperaturi (10-15 °C).

Gelatinizarea este procesul de umflare a granulelor, urmată de dezmembrarea structurii granulare, pentru care pierderea ordinii cristaline poate fi observată ca urmare a dispariţiei difracţiei de raze X. Încă dinainte de dezmembrarea granulei, unele materiale (în principal amiloza) încep să fie extrase prin dizolvare din aceasta. Acest material îşi majorează masa moleculară şi, odată cu ridicarea temperaturii, încă mai mult astfel de material ramificat este extras. Cu toate acestea, pe parcursul gelatinizării, nu este extrasă întreaga cantitate de amiloză. Modificarea morfologică a granulelor pe parcursul umflării depinde de originea amidonului.

Pentru unele variante, precum cele ce provin din cartofi şi porumb, granulele se umflă pe toate direcţiile, în timp ce în cazul grâului, orzului şi secarei umflarea este restricţionată pe o singură dimensiune, determinând o contracţie complicată a granulelor. Capacitatea de umflare a granulelor este în mod normal cuantificată prin puterea de umflare (greutatea granulelor umflate sedimentate per gram de amidon uscat) sau volumul de umflare (volumul granulelor umflate sedimentate per gram de amidon uscat) la o temperatură corespunzătoare 146 . Comportamentul de umflare a amidonului nu depinde exclusiv de originiea acestuia, ci şi de conţinutul de amiloză. În plus, retrogradarea are loc după pierderea structurii ordonate, în timpul gelatinizării amidonului, ceea ce conduce la sinereză sau separarea apei în cadrul sistemelor alimentare ce conțin amidon. Totuși, aceste neajunsuri ale amidonului pur pot fi depășite, de exemplu prin introducerea în molecule de mici cantități de grupări ionice sau hidrofobe. Schimbările modifică proprietățile amidonului, inclusiv vâscozitatea soluției, comportamenul de asociere și stabilitatea în cadrul produselor finale. Funcționalitatea amidonului poate fi modificată prin metode fizice, chimice și biotehnologice. Un alt scop al acestor alterări este cel de a stabiliza granulele de amidon pe parcursul procesării și de a face amidonul adecvat unui număr mai mare de aplicații.

Amidonul solubil utilizat de grad ACS a fost achiziţionat de la Sigma-Aldrich, are formula chimică (C 6 H 10 O 5 ) x şi o masă moleculară de 342,3. Este dispersabil în apă caldă si se prezinta sub forma unei pudre albe. ε-caprolactona a fost uscată pe site moleculare de 3 Å timp de 3 zile înaintea utilizării, iar Br-11 undecanolul dizolvat în toluen a fost menținut în tuburi Schlenck sub argon.

II.2. Metode și tehnici de lucru

II.2.1. Determinarea procentului fracțiilor amiloză/amilopectină din amidon

Amiloza poate forma complexe cu iodul şi diferiţi compuşi organici precum butanolul şi acizii graşi. Agenţii de complexare sunt încorporaţi în spiralele de amiloză. Aceste complexe sunt în mod esenţial insolubile în apă. Amiloza este extrasă cu uşurinţă din granulele umflate pentru temperaturi uşor peste cea de gelatinizare. Cantitatea de amiloză poate fi în mod normal izolată prin astfel de proceduri de extragere apoasă, prin metode de dispersie şi precipitare, respectiv ultracentrifugare. Amilopectina prezintă una dintre cele mai mari molecule din natură. Masa moleculară a acesteia este de 100 de ori mai mare decât cea a amilozei. Comparativ cu aceasta din urmă, structura amilopectinei este mai complexă, având în vedere că 4-5% din totalul de legături formează ramificaţii. Datorită dominaţiei sale generale în cadrul compoziţiei, structurii şi proprietăţilor granulare, amilopectina a fost intens studiată din prisma dimensiunilor şi structurii moleculare. Amidonul dispersat va avea o culoare albastru intens, datorită formării unui complex helicoidal între amiloză si iod, mai exact a unor helixuri de tipul V, alcătuite din 6 reziduuri glucozice anhidre pe încolăcire, cu un pas de 0.8 nm și un diametru al cavității elicoidale hidrofobice de 0.5 nm. McGrance și colab. 148 au arătat că iodul este prezent în aproape fiecare întorsătură a helixului amilozei, paralel cu axa sa lungă. Prepararea soluției de amiloză 10 mg (masă uscată) de amidon sunt solubilizate în 2 ml de DMSO la 60°C sub atmosferă inertă.

Soluția este diluată la 200ml cu apă. Se prelevează 10 ml din această soluție și se adaugă 83 mg de iodură de potasiu (ce corespunde unei soluții de 0.05N) înainte de dozaj.

Prepararea soluției de iod Se adaugă 100 mg iod și 830 mg KI în 2 ml de DMSO, apoi soluția este completată până la 100 ml cu apă și se lasă la agitat timp de o noapte pentru a permite să se solubilizeze cât mai bine.

Soluția este imediat pastrată la frigider, dar durata sa de utilizare rămâne limitată la aproximativ o săptămână.

După marcarea cu iod, conținutul total de amiloză a fost de 30%, iar cel de amilopectină de 70%. Spectrele RMN 1 H şi 13 C au fost înregistrate cu un spectrometru Bruker Avance III, funcţionând la frecvenţa de 400 MHz 1 H si 100.6 MHz pentru 13 C. S-au utilizat solvenţi deuteraţi.

II

II.3.1.2. Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (FT-IR) și cu transformată

Fourier prin reflectanță totală atenuată (FTIR-ATR)

Analiza IR s-a realizat cu un spectrometru Magna-IR Nicolet 550, 32 de scanuri, de la 400 la 4000 cm -1 folosind pastile KBr prin majorarea produsilor cu bromură de potasiu solidă şi aplicarea unei presiuni de 10 tone şi cu un spectrometru Nicolet IS10 Smart iTRdiamondATR de la 600 to 4000 cm -1 . În cazul compuşilor lichizi, filmele au fost depuse pe pastile de NaCl.

II.3.1.3. Analiza suprafețelor prin spectroscopie fotonelectron cu raze X (XPS)

Proprietățile de suprafață ale polimerilor sunt foarte importante în cadrul multor aplicații. Adesea, acestea sunt diferite. Printre tehnicile de analiză a proprietăților chimice ale suprafețelor polimerice, XPS și TOF-SIMS sunt esențiale. Datorită simplității sale în utilizare și interpretarea de date, XPS este probabil cea mai utilizată tehnică de analiză a acestor suprafețe. Este capabilă de a oferi informații elementare cantitative și asupra legăturilor chimice. Cu toate acestea, informațiile moleculare și asupra rezoluției spațiale sunt reduse. TOF-SIMS, pe de altă parte, oferă o combinație unică de specificitate moleculară ridicată, rezoluție spațială sub-micrometrică și sensibilitate superficială extremă, ideale pentru elucidarea complexei chimii aferente suprafețelor polimerilor. Este de asemenea unica metodă ce poate oferi simultan informații despre compoziție și morfologie. Totuși, TOF-SIMS are dezavantajul dificultății de generare a datelor cantitative. Prin urmare, XPS și TOF-SIMS reprezintă o excelentă combinație pentru caracterizarea suprafețelor polimerice.

Compoziţia chimică a suprafeţelor probelor a fost analizată prin spectroscopia cu raze X a fotoelectronilor (XPS) folosind un spectrometru cu fotoelectroni PHI-5000 VersaProbe (F ULVAC-PHI, INC), cu un analizor de energie hemisferică (0,85 eV rezoluţie de energie cu caracter obligatoriu, pentru materiale organice). O radiaţie monocromatică de raze X, Al Ka (h  = 1486.7 eV) a fost utilizată ca sursă de excitare. Standardul unghiului de decolare utilizat pentru analiză a fost de 45 °, producând o adâncime maximă de analiză în intervalul de 3-5 nm. Spectrul minim de rezoluţie a fost înregistrat în trepte de 0,5 EV cu o energie de trecere de 117.4 eV. În plus, spectre de înaltă rezoluţie au fost înregistrate în trepte de 0,1 EV cu o energie de trecere de Analiza termică a produşilor s-a realizat cu un DSC 822e de la Mettler-Toledo. Au fost folosite capsule ermetice de aluminiu (40μL) şi probele au cântărit între 4 şi 6 mg. Valorile au fost înregistrate de la primul ciclu de încălzire.

II.3.3. Determinarea unghiului de contact

Unghiul de contact a fost determinat prin metoda "picăturii" cu un aparat KRUSS DropShape Analysis system DSAMK2.

Tensiunea interfacială şi de suprafaţă poate fi măsurată cu un tensiometru optic, prin aşa-numita "metodă a picăturii".

Forma unei picături de lichid ce atârna de vârful unei seringi este determinată din raportul de forţe care include tensiunea de suprafaţa din acel lichid. Tensiunea de suprafaţă sau tensiunea interfaciala la interfaţa lichidului pot fi legate de forma picăturii prin următoarea ecuaţie:

γ = Δρ . g . R 0 2 / β ecuația (

II.3.4. Analiza capacității de micelizare

Difractrometria laser (DLS) a fost realizată folosind aparatul Malvern Nanosizer S echipat cu un fascicul generator de laser de 10 mW He/Ne ce operează la K5=633 nm unghi de 90°. Toate valorile au fost realizate în triplicate de zece măsurători fiecare, obţinute la 25°C. Pentru un coloid monodispers, indexul de polidispersitate ar trebui să fie sub 0.1, dar valorile ce depăşesc acest număr pot fi folosite în diferite comparaţii.

II.3.5.Microscopia electronică de baleiaj (SEM)

Microscopia de baleiaj (SEM) utilizată în cadrul acestei teze a utilizat un microscop Quanta 250 de la FEI .

II.3.6. Microscopia electronică de transmisie (TEM)

Microscopia electronică de transmisie (TEM) a fost utilizată pentru a observa direct morfologia şi polidispersitatea agregatelor copolimerice. S-a întrebuinţat un CM120 de la Philips, probele fiind observate la o tensiune de 80kv după uscarea unei picături de soluție de polimer pe o grilă de cupru acoperită de un film de carbon.

II.3.7. Determinarea gradului de retenție a apei

Gradul de umflare [Q%] a fost calculat conform ecuaţiei de mai jos:

x 100 ecuația

unde, m(t) reprezintă masa hidrogelului umflat la timpul t şi m(0) este masa iniţială a hidrogelului uscat. Rezultatele constituie valoarea medie a trei determinări.

II.3.8. Evaluarea in vitro a cineticii de incărcare/eliberare de principii active

Pentru studiile de înărcare/eliberare a fost utilizat un medicament model, levofloxacin, procurată de la Sigma Aldrich. Structura levofloxacinei este redată în schema 1. Schema 1. Formula levofloxacinei.

Determinarea cantităţii de medicament încărcat şi a cineticii sale de eliberare, s-a realizat cu ajutorul spectroscopiei UV-VIS. S-a utilizat un instrument de tip Nanodrop ND 100, ce permite analiza unui volum foarte mic de substanţă (de ordinul microlitrilor). Atât pentru studiile de includere cât şi pentru cele de eliberare a fost necesară realizarea unei curbe de etalonare.

Probele au fost cântărite şi apoi imersate în 10 mL soluţie de medicament în apă (10% w/w) unde au rămas timp de 24 de ore pentru definitivarea procesului de difuzie. S-a folosit ca medicament model, levofloxacina, un antibiotic hidrosolubil. Figura 3. Curba de etalonare pentru levofloxacină în apă Cantitatea maximă de medicament încărcat după 24 de ore a fost calculată spectrofotometric (lungimea de undă folosită pentru identificarea cafeinei a fost 300 nm) după cum urmează:

V C m m f L I L    , ecuația (3)
unde m Llevofloxacin încărcat (mg) m I -cantitatea iniţială de levofloxacin (mg) C Lfconcentraţia de levofloxacin în soluţia rămasă de medicament după îndepărtarea probei, calculată din curba de calibrare pentru levofloxacin în apă (mg/mL) V -volumul soluţiei de medicament rămas (m L ).

Hidrogelurile încărcate cu levofloxacin au fost imersate în 100 mL soluţie tampon (pH=7,4) în recipienţi acoperiţi și fixaţi într-o baie de apă cu termostatare şi agitare GFL 1092, la o temperatură de 37°C si o viteză de agitare de 60 rpm.

Cantitatea de medicament eliberat la anumite intervale de timp a fost monitorizată spectrofotometric. Rezultatele au constituit media a trei determinări.

Cantitatea maximă de levofloxacină eliberată a fost calculată folosind ecuaţia curbei de calibrare în apă şi masa fiecărei probe astfel: ecuația ( 4) Curba etalonare levofloxacin în apă unde: m Lcantitatea maximă de levofloxacin eliberată, C L -concentraţia levofloxacinei calculată din ecuaţia curbei de calibrare (A L = C L • 7,048 în apă) (mg/mL), m pmasa probei (mg).

y = 7.0487x R² = 0.
Determinarea cantitativă a medicamentelor cedate în mediul receptor, s-a făcut prin spectrofotometrie UV-VIS. II.3.9. Modelul teoretic de difuzie a principiului activ Ecuația de ordin 1 a lui Lagergren q t = q e * [1-exp(-k 1 *t)] ecuația (5) q t = cantitatea de xx absorbita la un anumit timp t (mg/g) q e = cantitatea de xx absorbita la echilibru (mg/g)

k 1 = constanta lui Lagergren (min -1 )
t=timp Ecuația de ordinul 2 a lui Ho q t = t*k 2 q e 2 / (1+t*k 2 q e ) ecuația ( 6) h= k 2 q e 2 k 2 = constanta relativa a acestui model [g/(mg*min)] Ecuația Korsmeyer-Peppas:

M t / M ∞ = Kt n ecuația (7) unde M t / M ∞ reprezintă fracția de medicament eliberat la timpul t, iar k este constanta ratei de eliberare și n exponentul de eliberare. Esterificarea amidonului(2 g, 0.012 mol) cu clorură de palmitoil(3.29 g, 0.012 mol) a fost realizată în 50 mL de dimetilformamida (DMF), pe o baie de ulei, sub o continuă agitare la 100° C timp de 6 ore, folosind piridina (1.13 g, 0.014 mol) drept acceptor de HCl. După ce mediul de reacţie a fost răcit la 50° C, un strat asemănător cu o răşină este separat de restul solventului. Produsul este precipitat într-un amestec de 70% (v/v) de etanol şi apă, sub o agitare puternică, apoi este filtrat şi uscat.

CAPITOLUL III MODIFICAREA CHIMICĂ

III.1.2. Analiza rezultatelor obținute

Polimerii naturali, cum este cazul amidonului, celulozei sau cel al proteinelor reprezintă o categorie interesantă de materii prime pentru diverse aplicaţii ce impun un caracter biodegradabil. În mod deosebit, amidonul este atractiv deoarece are un cost redus şi este abundent. Cu toate acestea, folosirea lui în stare nativă este limitată datorită rezistenţei scăzute, vâscozităţii ridicate (procesare slabă), fragilităţii ridicate şi incompatibilităţii cu polimerii hidrofobi. De aceea este necesară o modificare a acestuia în scopul hidrofobizării şi a îmbunătăţirii proprietăţilor mecanice. Dezvoltarea esterilor pe bază de amidon a început la mijlocul sec IX, cu cercetările lui Schuetzenberger care a reacţionat amidonul acetilat cu anhidrida acetică 149 . Reacţia de esterificare este catalizată de H+ şi are loc cu formarea de apă; poate fi realizată cu anhidride acide în medii apoase sau pe bază de solvenţi organici (piridină, DMSO, DMF sau isopropanol) cu catalizatorii acizi (acidul clorhidric sau sulfuric) sau alcalini (NaOH sau trietilamina) 150 . Catalizatorii neutri sau slabi acizi/alcalini duc la o substituţie regioselectivă la grupările hidroxil ale amidonului de la C2, pe când catalizatorii alcalini (cum sunt carbonaţii, hidrogenocarbonaţii, acetaţii şi fosfaţii) vor determina substituţii la C2, C6 şi C3 151 . Sinteza esterilor cu lanţuri lungi de acizi graşi ai amidonului a atras un interes vizibil în ultima perioadă, introducerea unui lanţ lung de acid (C12-C18) reducând fragilitatea amidonului nativ şi mărindu-i hidrofobicitatea 152 .

Insolubili în apă, esterii polizaharidici ai acizilor grași iși găsesc utilizarea în invelișuri pentru substanțe active și ca adezivi cu temperaturi înalte de topire. Dacă gradul de substituție al produșilor este prea mic, cum e in majoritatea cazurilor, atunci aceștia nu sunt suficient de hidrofobici. Permeabilitatea la apă a produșilor poate fi reglată ținând cont de lungimea lanțului acidului gras sau, prin amestecarea în produs a altor polimeri sau prin alterarea grosimii stratului de înveliș. Hidrofobicitatea poate fi indusă prin esterificarea parțială sau totală a amidonului. Agenții de esterificare preferați sunt cei cu formula RCO 2 H, unde, R reprezintă o grupare alchil C 1 -C 6 liniară sau ramificată, sau amestecuri, sau derivați ai acizilor sau ai amestecurilor de acizi. Gradul de hidrofobicitate și proprietățile fizice ale amidonului modificat pot fi manipulate prin selecția agenților de esterificare. Amidonul hidrofobic se degradează în două etape. În prima etapă, esterul este hidrolizat de acțiunea microorganismelor din mediul înconjurător, iar în a doua etapă, are loc acțiunea amilazelor.

Gradul de esterificare poate varia după cum se dorește de la unu la trei, pe unitatea glicozidică a amidonului (schema 1), sau în funcție de numărul de grupări hidroxilice pe unitatea monomerică a polizaharidei dorite. De asemenea, polizaharide similare sau diferite cu grade de esterificare variabile pot fi amestecate împreună pentru a atinge performanțele dorite.

Amidonul esterificat este stabil la atacul amilazelor, însă, în mediul înconjurător, legăturile lor esterice sunt hidrolizate de microorganisme ce secretă esteraze.Astfel, mai departe, polizaharidul devine disponibil atacului amilazelor care il vor transforma în unitățile sale monomerice, glucoza și dextrina. Schema 2. Structura chimică a amidonului reacționat cu clorura de palmitoil.

Mecanismul acestei reacții constă într-un prim pas în atacul nucleofilic al electronului liber al azotului din piridină asupra carbonului carbonil din clorura de palmitoil. Astfel, este creat un complex cu un atom de azot încărcat pozitiv și cu un atom de oxigen încărcat negativ. Gruparea carbonilică este regenerată ulterior în timp ce atomul de clor părăsește sistemul. Într-o a doua etapă, un atac nucleofilic echivalent, asupra carbonului carbonil din complex, este realizat de perechea de electroni liberi din oxigenul (gruparea hidroxilică) din amidon. Gruparea carbonilică este regenerată ulterior după eliminarea piridinei, un nucleofil puternic și o grupare ce pleacă ușor. Gruparea hidroxil nu este un nucleofil puternic care să poată efectua atacul nucleofilic din prima etapă, unde atomul de clor este o grupare ce pleacă bună, dar un nucleofil slab. Din acest motiv reacția nu are loc invers, adică un atac nucleofilic asupra grupării carbonil de către un ion de clor. Piridina acționează atât ca și catalist și ca solvent. În plus față de efectul catalitic, piridina, o bază organică minimizează deteriorarea amidonului în timpul esterificării deoarece neutralizează acidul clorhidric format ca produs secundar. Izolarea produsului final se face facil și randamentul este foarte bun. S-a folosit ca solvent pentru această reacție N,Ndimetil formamida (DMF), fiind cel mai avantajos 153 . Produsul obținut în urma reacției a fost precipitat cu un amestec de 50% apă și etanol.. Apa prezentă în etanol captează clorhidratul de piridină format și acizii grași liberi se dizolvă în etanol, produsul fiind insolubil în amandouă.

III.1.2.1. Analiza structurală a amidonului modificat cu lanțuri de clorură de palmitoil

III.1.2.1.1. Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR)

Prezența radicalilor de palmitoil a fost confirmată de apariția grupărilor carbonil ale esterilor (C = O) la 1742 cm -1 . Cele două pic-uri de intensități puternice ce corespund valorilor 2922 și 2851cm -1 sunt atribuite grupărilor metil și metilen asociate substituienților palmitoilici. Vibrațiile puternice ce apar la 3481 cm -1 , caracteristice grupărilor hidroxil ale amidonului nativ, sunt diminuate în intensitate după acilare, deoarece numărul lor scade. Intensitatea benzii OH de la 3600 la 3400 cm -1 depinde de DS-ul esterilor. Banda de vibrație a grupărilor metilenice crește cu Figura 1. Spectru FTIR pentru amidonul nemodificat și pentru amidonul esterificat cu clorura de palmitoil (SCP4).

III.1.2.1.2. Analiza suprafeței prin XPS și determinarea gradului de substituție

Spectroscopia RMN 1 H și 13 este o metodă preferată în determinarea DS-ului, dar cu precădere în domeniul polizaharidelor neramificate și foarte substituite, și în special pentru esteri. Marele avantaj al acestei analize este că polizaharida intactă poate fi analizată, evitând orice depolimerizare și pași ulteriori de preparare a probei. Dar, în același timp, natura polimerică are și un dezavantaj, datorită vâscozității ridicate și caracterului de amestec, semnalele sunt largi, de multe ori, prezintă o rezoluție slabă și asimetrică. Acestă vâscozitate și mărire a pic-ului poate fi parțial compensată de folosirea concentrațiilor scăzute, cu costul de a avea un semnal slab comparativ cu cel al artefactelor. De aceea, polizaharidele au fost parțial sau complet degradate de enzime, tartamente ultrasonice sau hidroliza acidă, rezultând un spectru RMN mai bun dar mai complex. Din acest motiv, adeseori pot avea loc calcule eronate datorită impurităților dacă semnalele de interes sunt ascunse de semnalele reziduurilor de reacție cum a fost cazul spectrelor noastre.

Gradul de substituție a fost calculat cu ajutorul analizei XPS (figura 2) dupa cum a fost descris anterior 154 , ca fiind raportul dintre suprafata pic-ului (-O-C-O) ce corespunde esterului și aria pic-ului -O-C-O din unitatea glucozidică (tabel 1). S-a obținut un grad ridicat de substituție pentru concentrații mari ale clorurii acide și pentru timpi de reacție lungi. S-a observat că un parametru important în maximizarea gradului de substituție este reprezentat de cantitatea de clorură de palmitoil folosită, pe când timpul este de o importanță minoră, iar temperatura nu are nici o influență în intervalul studiat. Piridina a fost folosită într-un exces constant față de clorura acidă de 0.22, cu excepția cazului când s-a verificat dacă aceasta are vreo influență asupra DS-ului. În ceea ce privește structura amidonului, și anume raportul amiloză, amilopectină, s-a arătat că amidonul cu 28% amiloză arată cea mai mare reactivitate, în timp ce amilopectina posedă cea mai mică reactivitate. Imaginile SEM au arătat schimbări semnificative în ceea ce privește morfologia amidonului după reacția sa cu clorura de palmitoil, trecând de la o structură granulară la una poroasă. Aceste imagini au fost obținute pe probe neliofilizate.

III.2. Modificarea chimică a amidonului solubil prin introducerea grupării alchine III.2.1. Principiul reacției

Principiul reacţiei constă în faptul că aceasta are loc între grupările hidroxil ale amidonului şi bromul din bromura de propargil, pentru a forma un eter propargilic. Prezenţa hidroxidului permite activarea funcţiilor hidroxil, iar isopropanolul facilitează solubilizarea bromurii de propargil (schema 3) 155 . Schema 3. Mecanismul reacţiei de modificare a amidonului cu bromură de propargil.

Reacția decurge astfel:

Se dispersează amidonul (6 g, 110 mmol de grupări hidroxil) într-un reactor cu mantă, prevăzut cu un refrigerent şi un agitator tip ancoră acţionat de un motor de 350 rpm (număr de rotaţii pe minut) în 100 mL de isopropanol și se agită la temperatura camerei timp de 10 minute. O soluție apoasă de hidroxid de sodiu (5 wt%, 31 mL, 39 mmol) se adaugă în picături şi după 1 oră, tot în picături, bromura de propargil (17 g, 110 mmol). Se agită la 60° C timp de aprox 3 ore.

Se dizolvă produsul final în apă și se precipită de două ori în isopropanol. Faza solidă se filtrează și se usucă sub nișă. Amidonul funcționalizat recuperat se prezintă ca o pudră de culoare galben pai (5.42 g).

III.2.2.1. Analiza structurală III.2.2.1. 1.Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier

Amidonul a fost funcţionalizat printr-o substituţie nucleofilică a bromurii de propargil cu alcoxizi de sodiu, conform unei proceduri descrise anterior de Tizzotti şi colab. [15] pentru funcţionalizarea alchinică a guarurilor.

Achizițiile spectrelor FT-IR au fost realizate cu un aparat SMART OMNI-Transmission Nicolet IS10, spectre înregistrate între 400 și 4000 cm -1 (32 scanări și o rezoluție de 4 cm -1 ) și sa făcut comparația cu cele ale amidonului nefuncționalizat (Figura 4), în urma căreia s-a observat prezența benzii de absorbție ν s =2117 cm -1 , caracteristică triplei legaturi, ceea ce a demonstrat reușita reacției. Achiziția spectrului pentru policaprolactona funcţionalizată (Figura 6), a ilustrat prezența benzii de absorbție ν s =2100 cm -1 , caracteristică grupării azidice. Figura 6. Spectrul FT-IR PCL-N 3 DP=13.

III.3.2.2. Rezonanța magnetică nucleară

Spectrul s-a înregistrat pe un spectrometru Bruker Avance 250 MHz. Ca solvent s-a folosit cloroform deuterat iar deplasările chimice (Figura 7) au fost exprimate în ppm, ținând cont și de referința reprezentată aici de tetrametilsilan (TMS) 157 .

Prin spectroscopia 1 H NMR, s-a determinat gradul de polimerizare 158 din intensitățile relative ale pic-urilor ce aparțin lanțului polimeric, H α sau H ε + H ε" și a celor aparținând grupului terminal metilenic H ε" .

Ținând cont de faptul că I α , I ε reprezintă valorile integralei pic-urilor de rezonanță, valoarea medie a gradului de polimerizare poate fi determinată folosind ecuațiile de mai jos:

ν s N3 2100 cm -1
Lungime de undă (cm -1 ) Transmitanță (%)

x n = sau x n = . Caracterizarea RMN 1 H a produsului final, a confirmat reușita reacției prin prezența picurilor caracteristice grupării azidice CH 2 N 3 la valoarea așteptată (Figura 7).

Azido-PCL: NMR 1 H (CDCl 3 , δ, ppm) : 1.24 (m, γ, γ"-PCL), 1.54-1.61 (m, β and β"-PCL), 2.23-2.29 (t, α and α"-PCL), 3.25 (t, α""-PCL and CH 2 N 3 ), 3.58-3.63 (t, ε"-PCL), 4.02 (t, ε-PCL); 13 C NMR (CDCl 3 , δ, ppm) : 25.2 (s, β-PCL), 25.8 (s, γ-PCL), 28.7 (s, δ-PCL), 32.3 (s, α-PCL), 51.4 (s, CH 2 N 3 ), 62.5 (s, ε-PCL), 173.5 (s, C=O).

III.3.2.3. Calculul gradului de polimerizare

Azido-policaprolactona a fost sintetizată în două etape. Mai întâi PCL-Br a fost obţinută printr-o polimerizare cu deschidere de ciclu a ε-caprolactone i cu TEA ca iniţiator şi 11-bromo-1-undecanol ca agent de transfer, folosind tehnici standard Schlenk, sub atmosfera inertă. Alcoxizii de aluminiu sunt iniţiatori eficienţi, ceea ce ne-a permis producerea în prezenţa alcoolilor că agenţi de transfer, a unor oligocaprolactone foarte bine funcţionalizate, cu o masă medie moleculară controlată 159,160 . Gradul de polimerizare pentru cele trei policaprolactone utilizate în grefarea lor pe scheletul amidonului a fost determinat din raportul integrării

N 3 O O O n-1 O      ' OH " " " " " " ' ' ' ' ,' '' ,'' ' ,','' ,', '' ,',''
semnalelor pertinente (α şi ε" de exemplu). Funcţionalizarea azidică a PCL a fost evidenţiată prin 1 H RMN prin apariţia semnalului caracteristic al azidei terminale la valoarea 3.24 ppm (Figura 1).

Polimerul PCL-Br de diferite grade de polimerizare (4, 13, respectiv 20) a fost sintetizat prin polimerizarea anionică a ε-caprolactonei, în prezența 11-bromo-undecanol ca agent de transfer și a trietilaluminiului (AlEt 3 ) pentru sinteza alcoolatului care va fi catalizatorul polimerizării.

Pentru a stabili cantitatea de ε-caprolactonă necesară obținerii poli(ε-caprolactonei) cu un grad de polimerizare de 10, calculul s-a efectuat conform exemplului de mai jos. Astfel, cunoscând ρ tol =0.9 g/cm 3 am determinat volumul V tol = =37.45 mL soluţie de bromoundecanol în toluen şi ulterior concentraţia, c = = = 0.5 x 10 -4 mol/mL

Dacă pentru

În următorul pas se determină câţi mL de AlEt 3 se vor adăuga în balonul de reacţie.

Astfel, ştiind că voi utiliza 10% de AlEt 3 :

x 7.19 x 10 -3 = 7.19 x 10 -4 moli de AlEt 3 şi concentraţia de AlEt 3 este de 1.1mol/L ceea ce înseamnă 1.1 x 10 -3 mol/mL x 7.19 x 10 -4 moli = 0.65 mL AlEt 3

Pentru un grad de polimerizare DP=10 se obţin 0.053 moli CL ( caprolactonă) x 114g/mol = 6.09 g. Ştiind că ρ CL =1.030 g/cm 3 se obţine volumul de caprolactonă ce va fi adăugat în mediul de reacţie V= 5.9 mL CL.

5 g de bromo-undecanol…………..37.45 mL x = 13.48 mL soluţie de BU 1.80 g bromo-undecanol…………..x mL

III.4. Concluzii

o S-a realizat esterificarea amidonului cu clorura de palmitoil. Mecanismul acestei reacții constă într-un prim pas în atacul nucleofilic al electronului liber al azotului din piridină asupra carbonului carbonil din clorura de palmitoil.

o În plus față de efectul catalitic, piridina, o bază organică minimizează deteriorarea amidonului în timpul esterificării deoarece neutralizează acidul clorhidric format ca produs secundar.

o Produsul obținut în urma reacției a fost precipitat cu un amestec de 50% apă și etanol. Apa prezentă în etanol captează clorhidratul de piridină format și acizii grași liberi se dizolvă în etanol, produsul fiind insolubil în amandouă.

o Prezența radicalilor de palmitoil a fost confirmată de apariția grupărilor carbonil ale esterilor (C = O) la 1742 cm -1 . Cele două pic-uri de intensități puternice ce corespund valorilor 2922 și 2851cm -1 sunt atribuite grupărilor metil și metilen asociate substituienților palmitoilici. Vibrațiile puternice ce apar la 3481 cm -1 , caracteristice grupărilor hidroxil ale amidonului nativ, sunt diminuate în intensitate după acilare, deoarece numărul lor scade.

o Intensitatea benzii OH de la 3600 la 3400 cm -1 depinde de DS-ul esterilor.

o Spectroscopia RMN 1 H și 13 este o metodă preferată în determinarea DS-ului, dar cu precădere în domeniul polizaharidelor neramificate și foarte substituite, și în special pentru esteri.

o Gradul de substituție a fost calculat cu ajutorul analizei XPS dupa cum a fost descris anterior, ca fiind raportul dintre suprafata pic-ului (-O-C-O) ce corespunde esterului și aria pic-ului -O-C-O din unitatea glucozidică.

o S-a obținut un grad ridicat de substituție pentru concentrații mari ale clorurii acide și pentru timpi de reacție lungi.

o S-a observat că un parametru important în maximizarea gradului de substituție este reprezentat de cantitatea de clorură de palmitoil folosită, pe când timpul este de o importanță minoră, iar temperatura nu are nici o influență în intervalul studiat.

o Imaginile SEM au arătat schimbări semnificative în ceea ce privește morfologia amidonului după reacția sa cu clorura de palmitoil, trecând de la o structură granulară la una poroasă.

o S-a realizat modificarea chimică a amidonului solubil prin introducerea grupării alchine. o Amidonul a fost funcţionalizat printr-o substituţie nucleofilică a bromurii de propargil cu alcoxizii de sodiu.

o Reacția are loc între grupările hidroxil ale amidonului şi bromul din bromura de propargil, ducând la formarea eterului propargilic.

o Prezenţa hidroxidului permite activarea funcţiilor hidroxil, iar isopropanolul facilitează solubilizarea bromurii de propargil.

o Sinteza azido poli (ε-caprolactonei) decurge în două etape: în prima se obține PCL funcționalizată pe capăt cu Br, iar în cea de a doua se introduce funcția azidă, terminală.

o Prin spectroscopia 1 H NMR, s-a determinat gradul de polimerizare din intensitățile relative ale pic-urilor ce aparțin lanțului polimeric, H α sau H ε + H ε" și a celor aparținând grupului terminal metilenic H ε" .

o Alcoxizii de aluminiu sunt iniţiatori eficienţi, ceea ce a permis producerea în prezenţa alcoolilor că agenţi de transfer, a unor oligocaprolactone foarte bine funcţionalizate, cu o masă medie moleculară controlată.

o Polimerul PCL-Br de diferite grade de polimerizare (4, 13, respectiv 20) a fost sintetizat prin polimerizarea anionică a ε-caprolactonei, în prezența 11-bromo-undecanol ca agent de transfer și a trietilaluminiului (AlEt 3 ) pentru sinteza alcoolatului care a fost catalizatorul polimerizării. Alchinele interne, cu ai lor carboni sp atașati la alți carboni, vor prezenta benzi slabe pentru legătura triplă, în regiunea 2100-2260 cm -1 . Totuși, această întindere este relativ redusă, nefiind câte-odată deloc prezentă în cazul în care alchina internă este simetrică. În aceste cazuri, spectrul IR își pierde valoarea de instrument util 161 . Alchinele terminale, pentru care carbonul sp este atașat la un hidrogen, vor prezenta benzi în spectrul IR atât pentru hidrogenul lor, cât și pentru legatura triplă. Întinderea C-H de pe alchina terminală tinde să se prezinte ca o bandă puternică și îngustă, în regiunea 3260-3330 cm -1 , în timp ce legătura triplă prezintă un pic slab la 2100-2260 cm -1 . Vor apărea curbe C-H adiționale între 610-700 cm -1 .

CAPITOLUL IV. GREFAREA POLI (ε-CAPROLACTONEI) PE LANȚURILE DE AMIDON

IV.2.1.2. Caracterizarea prin spectroscopie 1 H-RMN

Solubilizarea amidonului funcţionalizat cu triple legături, s-a dovedit ineficientă atât în D 2 O cât şi în DMSO şi semnalele protonului residual al apei s-au dovedit un factor perturbator pentru integrarea precisă a pic-urilor dorite şi astfel pentru calcularea DS-ului.

Astfel, analizele 1 H RMN şi FT-IR arătând că cicloaditia este cantitativă, am determinat DS alchina din spectrul copolimerului obţinut în urma reacţiei "click", presupunând că DS-ul este acelaşi înainte şi după cuplarea "click". Această procedură a fost aplicată cu success şi pentru caracterizarea guarului funcţionalizat cu PEG [15] . Pic-ul pentru protonul -CH 2 N 3 de la 3.24 ppm a dispărut complet şi un nou pic triazolic a apărut în intervalul 7.8 -8.1 ppm (Figura 2). Este important să menţionăm că acest DS este legat de funcţiile acetilenice implicate în formarea triazolului. Am descoperit cu surprindere faptul că amidonul propargilat a suferit o cuplare oxidativă tip Glaser, care a dus la formarea de legături -CC-CC-, în absenţa acetilurei de cupru, după cum este menţionat în literatură pentru reacţiile ce implică acetilene 162,163 . Se cunoaşte că oxidarea este promovată de folosirea acetilurilor de cupru, dar din punct de vedere preparativ, cele mai bune randamente ale dienelor sunt obţinute prin oxidarea acetilurilor de oxigenul liber şi nu de sărurile de cupru 164 . Până în prezent, în cazul amidonului propargilat, doar Tankam şi colab. 165 au raportat modificări neaşteptate, mai precis pierderea de reziduuri propargilice iniţiate de adiţia intramoleculară a OH-urilor libere la triplele legături, urmată de hidroliza acestor structuri enolice.

În cazul nostru, conform analizei 13 C RMN, semnalele atribuite carbonului C2 şi C4 din amidon au devenit foarte largi datorită substituţiei şi două pic-uri atribuite carbonilor cuaternari (80.9 ppm şi 77.3 ppm) au apărut sugerând prezenta structurilor diacetilenice.

Acest lucru este ilustrat în Figura 3 a spectrului de 13 C şi DEPT spentru amidonul acetilenic.

Este posibilă realizarea calculului pentru determinarea DS-ului direct pe amidonul acetilenic, când un spectru cantitativ RMN 13 C ste achiziţionat pentru aceste probe. Semnalele folosite pentru calcul sunt în acest caz ale carbonului C1 şi (C6+CH2CCH), toate grupările acetilenice fiind luate în considerare, atât cele libere cât şi cele cuplate. În mod contrar, DS-ul calculat din spectru RMN 1 H al polimerului click a inclus doar funcţiile acetilenice libere. Ca un exemplu, valoarea DS-ului probei CC20 a fost 0.25 conform spectrului 1 H şi 0.43 din carbonul cantitativ corespunzător unui procentaj de cuplare acetilenică în timpul sintezei.

Se poate observa de asemenea că semnalul carbonului la 80 şi 77 ppm este prezent atât înainte cât şi după reacţia "click" dar în rapoarte diferite. Semnalul de la 77 ppm păstrează aproape aceeaşi integrare, în timp ce intensitatea semnalului de la 80 ppm descreşte datorită formării grupării triazolice. Figura 3. Spectrul DEPT şi 1 H NMR pentru CC13.

IV.2.1.3. Analiza suprafeței prin XPS

Analiza XPS a fost folosită pentru investigarea din punct de vedere chimic a schimbărilor rezultate în urma modificării suprafeţei amidonului nativ şi modificat. S-a efectuat deconvoluţia pic-ului C1s din spectrul XPS pentru fiecare probă, după cum este ilustrat în S-au observat pe probele analizate ioni ce conţin cupru (Figura 7), investigaţie ce a permis determinarea timpului necesar purificării polimerilor. Aceasta determinare este imperioasa pentru produsele sintetizate deoarece se doreşte utilizarea lor în aplicaţii biomedicale. Termogramele ilustrează topirea (în timpul încălzirii) şi recristalizarea (consecutivă răcirii) a lanţurilor de PCL grefate pe scheletul amidonului. După cum este de aşteptat, cu cât este mai mică lungimea lanţului, cu atât sunt mai scăzute temperaturile de topire şi recristalizare. Datorită masei medii moleculare reduse, polimerul cu lungimea lanţului de PCL, X n = 4, are aspectul de ceară, în timp ce ceilalţi sunt sub formă de pudră.

PCL este un polimer semi-cristalin cu un punct de topire în jurul a 60 ° C și cu T g de -60° C 170 . Se poate observa că în intervalul de temperatură studiat, scheletul amidonului induce efecte perceptibile, temperatură de topire T m corespunzătoare temperaturii de topire a fazei cristaline din PCL este detectată în jurul valorii 35-45° C. Toate cele trei curbe arata endoterme probabil relaţionate cu topirea cristalelor de diferite mărimi din copolimerii finali. Răcirea arata exoterma de re-cristalizare. Al doilea pasaj încă arată endotermele dar cu valori mai scăzute decât cele din primul pasaj, fapt ce poate indică o fuziune a cristalelor de dimensiuni mai mici sau mai puţin «perfecte». Efectul de stabilitate termodinamică este clar vizibil pentru CC20 şi CC13, datorită lanţurilor lungi de policaprolactonă, dar nu există o diferenţă semnificativă între cele două probe deoarece începutul fuziunii este acelaşi dar maximul endotermei este mai mare pentru CC13 decât pentru CC20.

Tabelul 4 arată comportamentul la topire și recristalizare al PCL-ului din copolimerii investigați pentru trei rate de răcire diferite.

Tabelul 4. Valorile entalpiei sunt similare atât pentru topire cât şi pentru re-cristalizare, pentru fiecare probă, dar diferă gradual pe măsură ce lungimea lanţului creşte. O posibilă explicaţie ar fi că formarea cristalelor este mai dificilă şi depinde de lungime.

5°C/min

Probă

Valorile crescute de energie pentru CC20 sunt correlate cu o mai bună stabilitate, fapt deja arătat prin ATG.

Această valoare a entalpiei este expresia unei cantităţi mari de cristale prezente în CC20 şi în cazul acestei probe, această valoare este corelată cu rezultatele obţinute din ATG. Faptul că temperatura este mai mică decât în cazul CC13, poate fi explicat prin cantitatea mică de cristale din probă, ce îi afectează stabilitatea. Profilul ATG arată o mai mare stabilitate pentru PCL cu lanţuri lungi, dar stabilitatea termodinamică observată pentru fuziune nu respectă această corelaţie cu lungimea lanţului: maxima este pentru CC13 în loc de CC20. Se poate formula o ipoteză, cum că lungimea lanţului de PCL contribuie la stabilitatea termodinamică a produsului, de aceea cu cât este mai lung, cu atât mai rezistentă la temperatura este proba finală şi, pe de altă parte, lungimea lanţului induce cristale mai stabile din punct de vedere termodinamic, adică temperatura de topire este mai ridicată.

IV.1.1.3.1.Determinarea gradului de cristalinitate din PCL după grefare Scăderea cristalinităţii a fost cel mai probabil cauzată de dificultatea crescută în aranjarea lanţului polimeric, datorită mişcării nepermisive a segmentelor polimerice din amidon. Calculele au fost efectuate ca în modelul de mai jos:

Pentru PCL pur ΔH f = 142 J/g Pentru PCL-N 3 DP=13, ΔH f = 107 J/g de unde rezultă o cristalinitate de 75%.

Pentru a realiza cuplarea "click", s-au folosit 100 mg de amidon, adica 6.17 x 10 -4 moli de ciclu polizaharidic.

Ştiind că DS=0. Morfologia copolimerilor a fost studiată cu ajutorul microscopiei de baleiaj. O modificare evidentă este observată în cazul probelor grefate comparativ cu amidonul de plecare. De la un aspect granular (d), până la probe cu lanţuri lungi de PCL ce prezintă o structură cu pori bine definiţi.

IV.1.1.5. Comportamentul copolimerilor în diferiți solvenți

Comportamentul la umflare al copolimerilor grefaţi în diferiţi solvenţi a fost investigat calitativ, pe o scară de la 0 la 5, după 24 de ore de agitare, fără nici o cuantificare a gradului de umflare. După cum era de aşteptat, doar CC4 a arătat afinitate pentru apă, datorită lanţului scurt hidrofobic. DMSO s-a dovedit cel mai bun solvent pentru toţi copolimerii, indiferent de lungimea lanţului de PCL. Figura 12. Comportamentul copolimerilor CC4, CC13, CC20 în diferiți solvenți.

Cloroformul, solvent nepolar, prezintă aceeaşi capacitate de umflare pentru toţi copolimerii. În schimb, toluenul arată o creştere a gradului de umflare odată cu creşterea lanţului de PCL.

Acetona, care din punctul de vedere al polarităţii se situează între apă şi cloroform, respectiv toluen, umflă mai puţin copolimerii, capacitatea ei de umflare scăzând cu creşterea lungimii grefelor.

IV.1.1.6. Investigarea proprietăților de micelizare ale copolimerilor

Datorită caracterului amfifilic al acestor copolimeri, a fost investigată abilitatea lor de a se organiza în structuri micelare.

Pentru a prepara soluţii micelare din copolimerii bloc, s-a adăugat în picături apă dublu distilată (1 ml) la o soluţie polimerică (5mg) de THF (20 ml) aflată sub o agitare blândă. Soluţia micelară a fost obţinută după evaporarea lentă a THF la rotavap, folosind pompa de vid (30 ºC, 3h). Concentraţia finală a fost de 0.5mg/mL atât pentru măsurătorile DLS cât şi pentru TEM. Investigaţii complementare au fost efectuate privind dimensiunea micelelor polimerice şi distribuţia lor dimensională prin măsurători de DLS, când s-a constatat un fenomen de agregare a ce a tulburat distribuţia diametrelor, dând naştere la o creştere a polidispersităţii. O variantă ce poate explica dimensiunea diferită a particulelor detectată de TEM şi DLS constă în prepararea probei. Măsurătorile DLS au fost realizate în soluţii în timp ce agregatele polimerice depuse pe gridele de carbon au implicat uscarea probelor, fapt ce a condus, în cel mai probabil caz, la micşorarea particulelor şi prin urmare la diametre mai mici detectate prin TEM.

De asemenea, în timpul procedurilor de pregătire, auto-asamblările polimerice pot fi aplatizate pe grilele TEM datorită forţelor de absorbţie.

Compușii obținuți sunt solubili în solventi organici și în anumite condiții ei se pot autoasambla. În contact cu soluții apoase, lanțurile moleculare tind să se reorganizeze, formând agregate de tip micelar datorită asocierilor intra sau inter-moleculare dintre componentele hidrofobice, pentru a minimiza energia liberă interfacială. Concentrația critică micelară (CMC) este concentrația minimă necesară pentru un polimer de a forma micele prin procedeul de autoasamblare. Concentrația critică de agregare (CAC) este definită ca o concentrație minima necesară pentru ca polimerul sa poată agrega. În mod normal, valorile CMC sunt mai mari decât CAC. Acești parametri sunt indicatori necesari pentru abilitatea de micelizare și pentru stabilitatea micelelor. Micelele sunt supuse unei diluții extreme după injectarea intravenoasă în corpul uman. Dacă sunt stabile din punct de vedere cinetic, o disociere lentă permite micelelor polimerice să-și mențină integritatea și conținutul în medicament pe perioada circulării în mediul sangvin deasupra sau sub raportul CMC/CAC pentru un anumit timp.

Un raport scăzut CMC/CAC poate garanta că micelele vor reține morfologia originală până în momentul atingerii zonei țintă, fapt ce constituie un avantaj al polimerilor amfifilici în comparație cu surfactanții mici moleculari 171 .

În ceea ce privește prepararea micelelor două metode sunt mai exploatate. Prima metodă este implică dizolvarea directă a copolimerului în apă sau în mediu apos. Tehnica dializei, a doua metodă, necesită dizolvarea copolimerului mai întâi în compuși organici miscibili cu apa, cum este dimetilformamida, tetrahidrofuranul sau dimetilacetamida și apoi amestecarea soluției cu apa la o rată controlată, cu eventuala evaporare a solventului organic, ce duce la obținerea moleculelor de copolimer sub formă de micele în apă.

Alegerea metodei se face în funcție de solubilitatea copolimerului în apă sau în medii apoase. Dacă solubilitatea copolimerului este satisfăcătoare, se preferă dizolvarea sa directă, în timp ce pentru o solubilitate scăzută se preferă metoda dializei.

Moleculele amfifile constau în două segmente diferite, care diferă prin solubilitatea lor și care este determinată de lungimea blocurilor.

În metoda dializei, dimensiunea și distribuția dimensională a micelelor este influențată de solventul organic ales și de rata de amestecare a acestuia cu apa. La o concentrație critică a apei, este inițiată formarea micelelor, iar după acest punct numărul lor continuă să crească. La și colab. 172 au folosit această metodă pentru sistemul lor micelar și au aflat că solventul afectează dimensiunea micelelor. Folosirea DMSO-ului ca solvent organic a dus la creșterea micelelor de poli(etilen oxid)-poli (benzil-L-aspartat) la dimensiunea de 17nm cu un randament de 6%. În cazul N,N-dimetilacetamidei(DMAc), micelele au fost obținute cu un randament mare, cu o dimensiune medie de 19 nm și cu o distribuție restrânsă. Astfel, metoda dializei poate fi folosită pentru a modela proprietățile micelelor în funcție de cerințele aplicației dorite.

Încărcarea moleculelor de medicament în miezul hidrofob al micelelor depinde de modul de preparare al acestora. Dacă metoda de dizolvare directă este folosită, amestecul de soluție de medicament poate fi preparat cu un solvent organic de tipul acetonei, ca strat protector. Apoi, amestecarea soluției micelare și soluției de medicament duce la încorporarea acesteia din urmă după evaporarea solventului în care s-a realizat soluția de medicament. Motivul folosirii acestui solvent este ca el poate solubiliza partea hidrofobică a copolimerului și a moleculelor de medicament. În timpul adăugării solventului organic ce conține copolimer și a moleculelor de medicament în apă, se formează micelele, medicamentul fiind încorporat în miezul micelar în același timp.

Având micelele formate și moleculele de medicament încorporate, următorul pas este transportul acestora fără a afecta în nici un fel circuitul sangvin. Din punct de vedere termodinamic, stabilitatea micelelor este măsurată cu ajutorul concentrației critice micelare. După cum s-a menționat în partea bibliografică, forțele opuse create de părțile hidrofobice și hidrofilice ale micelei necesită o limită inferioară pentru a menține stabilă structura sistemului de eliberare a medicamentului. Această limită devine importantă în momentul administrării intravenoase deoarece concentrația sistemului scade imediat și poate duce la disocierea micelelor, care la rândul lor vor conduce la eliberarea moleculelor de medicament. Pentru acest motiv, valoarea CMC ar trebui controlată foarte bine și luată în considerare cand se crează sisteme micelare noi pentru aplicații terapeutice.

Valorile CMC depinde de raportul dintre lungimea părții hidrofobice și a părții hidrofilice. Un raport scăzut duce la o valoare mare a CMC comparativ cu un raport ridicat, deoarece forțele de atracție ce apar din segmentul hidrofobic duc la autoasamblarea micelelor și scăderea ponderei lanțului hidrofobic conduce la creșterea CMC-ului.

Numeroase studii au fost realizate până în prezent pentru a înțelege cum anume lungimea lanțului afectează CMC. Astafieva și colab. 173 au investigat efectele lungimii lanțului polimeric asupra CMC în cazul micelelor copolimerului polistiren-b-poli(acrilatului de sodiu). În cazul solventului apă, micelele formează zona miezului din blocuri de polistiren insolubil și hidrofob și în zona coroanei, din blocuri PAN hidrofilice. Creșterea raportului segmentelor hidrofobic/hidrofilic de la 6/400 la 110/380 unități monomerice rezultă într-o descreștere dramatică a CMC-ului de la 4.2*10 -5 la 8*10 -8 mol/L. În 2008, un studiu mai recent a fost realizat de Wang și colab. 174 , în care CMC a fost determinat prin folosirea unei metode de fluorescență spectroscopică bazată pe partiționarea preferențială a probei de piren în miez hidrofobic într-un mediu apos și s-a concluzionat că creșterea polimerizării blocului hidrofobic, PCL, de la 27 la 186 unități în copolimerul tribloc poli(etil etilen fosfat) și poli (ε-caprolactonă) (PEEP-PCL-PEEP) a dus la odescreștere substanțială a CMC de la 10.2 la 0.55*10 -3 g/L -1 .

Astfel, așa cum o arată și aceste studii, creșterea segmentului hidrofobic a copolimerului descrește valoarea CMC care îmbunătățește potențialul lor de a fi folosite în tratamente actuale prin prevenirea disocierilor sistemelor de eliberare a medicamentelor odată cu administrarea lor intravenoasă.

Alte proprietăți cruciale ce ar trebui considerate în ceea ce privește prepararea sistemelor de eliberare a medicamentelor sunt dimensiunea și distribuția dimensională a micelelor. Acele micele ce sunt mai mici decât 200 nm sunt mai puțin susceptibile la clearence și cele mai mici de 5 μm sunt capabile de a pătrunde capilarele mici. Astfel, dimensiunea micelelor este unul din factorii determinanți ai eficacității acestor sisteme și de aceea parametrii ce afectează dimensiunea micelelor sunt necesari a fi relevați.

În plus față de caracteristica de dimensiune, distribuția dimensională a micelelor este un aspect important pentru sistemele de eliberare a medicamentelor. Ar trebui să fie evident faptul că micelele de dimensiuni de 10 și 200 nm vor prezenta un timp de eliminare și o circulație diferită.

Pentru a câștiga mai multă putere de control a injectării și a eliminării sistemelor de medicament, distribuția dimensională a micelelor trebuie sa fie cât mai uniformă. Una din explicațiile acceptabile de ce unele micele sunt mai mari decât altele, deși sunt formate în același solvent, este aceea că clusterele de dimensiune mare pot fi formate prin aglomerarea micelelor de mici dimensiuni datorită forțelor de atracție secundare dintre miezurile hidrofobice ale micelelor. Pentru a evita formarea acestor agregate mari, concentrația soluției poate fi scăzută prin diluție.

Creșterea dimensiunii autoasocierilor când se folosește THF drept co-solvent, s-a mai explicat prin faptul că amestecarea acestuia cu apa se face foarte lent, datorită vâscozității mari și miscibilității scăzute cu aceasta. S-a raportat în literatură obținerea de particule mai mari atunci când s-a adăugat faza organică de THF peste faza apoasă, comparativ cu situația când ordinea de adăugare a fost inversă, acest lucru datorându-se ratei rapide de precipitare. S-a mai arătat că se pot obține morfologii variate dacă copolimerul este asimetric în lungimile relative ale blocurilor componente (ex. blocul hidrofobic este în mod considerabil mai lung decât cel hidrofilic) și particulele sunt pregătite prin adăugarea lentă a apei peste polimerul dizolvat într-un solvent organic miscibil cu apa, după cum a fost și cazul nostru. Astfel, conform unor studii anterioare, aceste aggregate micelare pot forma morfologii multiple care sunt dependente de lungimea blocurilor copolimerului, morfologii ce includ sfere, bastonașe, vezicule (polimerosomi), micele lamelare.

Autoasamblarea copolimerilor amfifili în polimerosomi s-a demonstrat a fi dependentă de blocul hidrofilic 175 , în cazul nostru amidonul.

IV.1.1.7.Concluzii

A fost obținut și caracterizat un nou copolimer pe bază de amidon grefat cu poliester prin procedeul click chemistry.

Introducerea unităţilor de PCL a eliminat unele dezavantaje ale polizaharidei abordate, prin mărirea hidrofobicitatii amidonului şi de asemenea prin creşterea cristalinităţii copolimerului prin varierea lungimii lanţului de PCL, după cum s-a putut observa din analiza DSC. Caracterul amfifilic al copolimerului a fost evidenţiat prin capacitatea sa de a forma polimerosomi în soluţii apoase. Copolimerii grefaţi pot fi astfel potenţiali candidaţi pentru a fi folosiţi în diferite aplicaţii biomedicale.

IV.1.2.2. Influența solventului asupra timpului de reacție

Iradierea cu microunde constă într-o iradiere electromagnetică în intervalul de frecvență de 0.3 până la 300 GHz. Toate cuptoarele domestice și reactoarele cu microunde dedicate sintezelor chimice operează la o frecvență de 2.45 GHz, pentru a evita interferențele cu telecomunicațiile și cu frecvențele telefoanelor mobile. Energia fotonului de microunde în această regiune de frecvență (0.0016 eV) este prea slabă pentru a rupe o legătură chimică și este de asemenea mai mică decât energia de mișcare browniană. Astfel, microundele nu pot induce reacții chimice 176 . Chimia amplificată de microunde se bazează pe încălzirea eficientă a materialelor prin încălzirea dielectrică cu microunde. Acest fenomen este dependent de abilitatea unui material specific (solvent sau reactiv) de a absorbi energia microundelor și de a o converti în căldură.

Caracteristicile de încălzire ale unui anumit material (un solvent, spre exemplu) în condiţii de iradiere cu microunde sunt dependente de proprietăţile sale dielectrice. Capacitatea unei substanţe de converti energia electromagnetică în căldură la o frecvenţă și temperatură dată este determinată de aşa-numitul factor de pierdere tanδ. Acesta este exprimat drept coeficientul tanδ = e""/e", unde e"" este pierderea dielectrică, ceea ce reprezintă un indicator al eficienţei cu care radiaţia electromagnetică este transformată în căldură, iar e" este constanta dielectrică, ce descrie abilitatea moleculelor de a fi polarizate de către câmpul electric. Este necesar un mediu de reacţie caracterizat de o valoare ridicată a lui tanδ pentru o absorbţie eficientă şi, prin urmre, pentru o încălzire rapidă. Factorii de pierdere aferenţi unor solvenţi organici simpli sunt cuprinşi în tabelul imediat următor. În general, solvenţii pot fi clasificaţi ca absorbanţi puternici (tanδ > 0.5), medii (tanδ = 0.1 -0.5) sau slabi (tanδ < 0.1) de microunde.

Tabel 7. 177 Factorul de pierdere tanδ pentru diferiți solvenți.

Solvent tanδ Solvent tanδ

Etilen S-a arătat că umflarea granulelor de amidon începe în masa fracției mobile amorfe și în regiunea mai moderat amorfă, imediat adiacentă regiunii cristaline. Atât capacitatea de umflare cât și solubilitatea crește cu creșterea temperaturii, dar descresc după iradierea cu microunde 178 .

Tester și Morrison 179 au arătat că umflarea este o proprietate primară a amilopectinei și că amiloza acționează ca un diluant. Reducerea proprietății de umflare și a solubilității poate fi explicată printr-un rearanjament al regiunii cristaline din granulele de amidon, care pot fi distribuite aleatoriu.

Rezultatele raportate de Luo Z. și colab. au arătat că tratamentul cu microunde a indus rearanjarea moleculelor în secțiuni ale amidonului ce fac parte din regiunea cristalină și că iradierea a avut un efect mai pronunțat asupra amilozei decât asupra amilopectinei. Curbele DSC au arătat că cristalele imperfecte se topesc și recristalizează în altele mai perfecte.

Pinkrova și colab. 180 au arătat că la o putere de 90 kW și la o temperatură de 100°C dintr-un total de 86.71% amidon, doar un conținut de 4.47% este degradat.

Ritter 181 a arătat recent că prezența apei crește randamentul reacției click cu microunde, datorită efectului ei favorabil asupra sistemului catalitic. CEM monomodal, iradiere la 150 C, 130 W timp de 30 min.

Iradierea cu microunde a fost primită cu mult interes în domeniul chimiei datorită încălzirii rapide şi a penetrării omogene de energie în comparaţie cu metodele convenţionale de încălzire 182 . Au fost dezvoltate multiple protocoale rapide şi eficiente energetic pe bază de microunde şi aplicate în sinteza sau modificarea de polimeri sau materiale 183 .

Cu toate acestea, aspectul de control al selectivităţii reacţiilor chimice prin utilizarea activării MW în sisteme închise sau deschise este un domeniu fascinant, care însă nu este încă pe deplin înţeles. Principalul motiv pentru progresul din reacţiile chimice este de fapt un simplu efect termic / cinetic, o consecinţă a temperaturii rapid obţinute şi a presiunii mai mari (în recipiente închise ermetic). Mecanismul de încălzire dielectric produce efecte specifice microundelor, care diferă de încălzirea convenţională. Un solvent cu o putere mare de absorbţie a microundelor poate fi supraîncălzit mai sus de punctul lui de fierbere prin utilizarea unui recipient sigilat. Catalizatorii sau reactivii eterogeni polari duc adesea la accelerarea reacţiei întrun mediu mai puţin polar 184 185 .

În ceea ce priveşte polizaharidele, recent, Peng şi colab. 186 au investigat aplicaţiile iradierii cu microunde în sinteza carboximetil hemicelulozei, studiind structură chimică, masa moleculară, proprietăţile termice şi reologice. Produşii au fost obţinuţi prin schimbarea condiţiilor de reacţie. Puterea de iradiere a fost menţinută la 300 W pentru toate procedurile, timpii de reacţie au variat de la 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 30, până la 40 minute şi temperaturile au fost 30, 45, 65, şi 85 °C. "Click chemistry" asistată de MW este propusă ca o cale nouă de sinteză pentru obţinerea de compuşi heterociclici într-o reacţie singulară, şi într-o manieră complet regioselectivă.

Timpul de reacţie poate fi scăzut de la ore la minute 187 . Astfel, această metodă aplicată:

click chemistry", a fost descrisă pe larg în literatura de specialitate. Liskamp şi colab. 188 au sintetizat, folosind această reacţie, peptide dendrimerice multivalente.

Impactul ridicat al microundelor în ceea ce priveşte progresul reacţiei a fost demonstrat prin randamente ridicate de 96% în comparaţie cu 43-56%, în condiţii convenţionale de încălzire pe baie de ulei. Morvan şi colab. au descris cuplarea eficientă a oligonucleotidelor purtătoare de grupări alchinice cu galactozide funcţionalizate azidic 189 , demonstrând că microundele au îmbunătăţit semnificativ cinetica reacţiei.

Poli (ε-caprolactona) sub formă de stea a fost sintetizată prin "click chemistry" asistată de microunde de Schubert şi colab. 190 , care au folosit poli (ε-caprolactona) funcţionalizată acetilenic şi azido-β-ciclodextrina.

IV.1.2.3. Analiza structurală

IV.1.2.3.1. Caracterizarea prin spectroscopie FTIR

Pentru a fi siguri că microundelor nu vor degrada amidonul, s-a pus la punct un protocol experimental cu o putere de iradiere de 150 W, raportată anterior ca fiind inofensivă în ceea ce priveşte polizaharidele.

Pentru a determina timpul necesar finalizării reacţiei "click" s-a realizat o cinetică din 20 în 20 de minute, monitorizată cu ajutorul FT-IR-ului. Spectrele au fost înregistrate folosind o celulă de NaCl. Figura 18 . Cinetica FT-IR pentru "click chemistry", cu ajutorul MW.

IV.1.2.3.2. Rezonanța magnetică nucleară ( 1 H-RMN)

Spectrele RMN 1 H si 13 C au fost înregistrate în aceleaţi condiţii ca în cazul cuplajului prin metoda convenţională şi nu s-au observat diferenţe între ele. Figura 18. Spectru RMN 1 H pentru MW2 cu un DP PCL = 13. Astfel, temperatura de reacție a fost redusă de la 24 ore la doar 60 de minute. Cu toate acestea, acest lucru nu este valabil decât pentru un mediu de reacție consituit dintr-un amestec apă/DMF, concluzie observată în urma unui spectru proton al unei reacții realizate într-un amestec apă/THF, când am descoperit că după 60 de minute înca aveam prezența azidei. Explicația acestui lucru constă în faptul că absorbția energiei generate de microunde este mai ridicată în cazul DMF-ului decît în cazul THF-ului, aspect definit de un factor numit tan δ.

Pentru DMF acest factor este tan δ=0.161 și pentru THF, tan δ=0.047. S-a observat că pentru MW1 și MW4, deoarece reacția nu a fost completă în 60 de minute, fiind realizată într-un amestec H 2 O/THF, termogramele prezintă încă amprenta puternica a amidonului, ceea ce nu este cazul pentru MW2 și MW3. Pic-urile corespunzătoare degradării termice a amidonului și PCL-ului au fost aceleași atât pentru probele cu cuplaj complet cât si pentru celelalte, prezentând valori identice cu click-ul realizat prin metoda convențională.

Faptul că cele două reacții nu au fost complete s-a văzut și prin analiza de suprafață Tof-Sims, prin prezența puternică a pic-ului N 3 la valoarea corespuzătoare, 26.

Urmând procedura descrisă la capitolul IV. 1.1.4., de determinare a cristalinității PCL după grefare, s-a constatat ca nu au fost diferențe considerabile între valorile obținute pentru reacția clasică și cea cu microunde. Reacţia generală de polimerizare are loc astfel: ε-CL (3 g, 0,026 mol ) se adăugă peste amidonul (3 g, 0,018 mol) uscat în prealabil o noapte la etuvă la 50°C. Se introduce o cantitate determinată de trietilaluminiu în soluţie de toluen printr-o seringă, la temperatura camerei. Apoi, mediul de reacţie se încălzeşte la temperatura dorită. Polimerizarea se opreşte prin răcirea rapidă la temperatura ambiantă. Reacţia are loc într-un balon prevăzut cu trei gâturi pentru a permite evaporarea substanţelor volatile, dar și condensarea lor într-un refrigerent, şi menţinerea unei atmosfere inerte. Lanţurile de PCL negrefate sunt îndepărtate prin extracţia cu toluen (25 mL) la temperatura camerei. După 24 ore, fracţia insolubilă este filtrată, purificată prin dializă într-o soluţie 0,1 M EDTA pentru îndepărtarea Al din sistem folosind o membrană celulozică de dializă (Orange Scientific, MWCO: 3500 Dă) şi în final uscată sub vid. Partea insolubilă conţine lanţuri de amidon şi poliester care au fost grefate chimic.

IV.2.1. Analiza rezultatelor obținute

Metodele convenționale de procesare furnizează de obicei compozite pe bază de amidon cu proprietăți mecanice scăzute, în principal datorită descompunerii termice a amidonului, absorbției puternice a apei și a adeziunii interfaciale scăzute. Amestecurile polimerice și asocierile chimice, sub formă de copolimeri bloc sau grefaţi între amidon și poliesterii alifatici, cum e cazul poli(-caprolactona), prezintă un interes deosebit din punctul de vedere al obținerii unor noi materiale biodegradabile. 191

Copolimerul bloc poli(-caprolactona) -amidon se pare a fi candidatul ideal deoarece în primul rând este rezistent la tratamente apoase, în al doilea rând, deoarece poli(-caprolactona) oferă o bună biocompatibilitate combinată cu o bună permeabilitate pentru numeroase medicamente terapeutice și o compatibilitate cu o gamă largă de alți polimeri 192 .

O cale de a realiza un astfel de copolimer, cu dimensiune controlată a secvenţei de polimer sintetic, o consituie utilizarea reactiei "click-chemistry". Aceasta presupune realizarea anterioară a unor derivaţi terminaţi în gruparea azido, respectiv în grupare alchină, prin modificarea polimerilor de bază (amidonul, respectiv PCL). Este cunoscut faptul că poli(-caprolactona) este un poliester alifatic biodegradabil și biocompatibil ce a beneficiat de o atenție sporită în utilizarea sa în domeniul medical, farmaceutic și în diverse aplicații ce țin de mediul înconjurător 193 .

Monomerul ε-caprolactona, este esterul ciclic al acidului hidroxi caproic și este un lichid incolor.

Inelul lactonic se desface relativ ușor cu ajutorul compușilor ce conțin atomi de hidrogen, în mod special alcooli, fiind necesari însă și temperaturi ridicate și catalizatori. Fiecare deschidere de ciclu duce la formarea unei grupări hidroxilice primare, terminale, si a uneia carboxilice.

Alcoxizii de aluminiu [R3-nAl(OR) n ] sunt folosiți în mod curent drept inițiatori în sinteza poli(lactonelor) și poli(lactidelor). Datorită faptului că alcoxizii de aluminiu pot fi obținuți în urma reacției dintre un alcool și trialchil-aluminiu, o gamă largă de alcooli este disponibilă drept opțiune pentru structura terminală α 194 .

Pasul cheie în ceea ce privește această polimerizare este reacția de transfer care are loc în momentul adăugării alcoolului în mediul de reacție.Această reacție de transfer păstrează în capătul terminal al lanțului polimeric o grupare hidroxil ce poate fi folosită mai departe în altă reacție de transfer. Dacă alcoolul este în exces comparativ cu inițiatorul, gradul de polimerizare dorit este dat de raportul [monomer]/[alcool].

Numeroase informații experimentale din literatură confirmă într-adevar faptul că masa moleculară poate fi prezisă din raportul molar monomer/inițiator și că distribuția masei moleculare este limitată, paralel cu o inițiere rapidă spre deosebire de propagare. Viteza de propagare aparentă crește mai întâi cu excesul de alcool până la o valoare specifică, peste care cinetica încetinește. Obținerea unui poliester ce nu conține reziduu toxic metalic este o condiție obligatorie pentru aplicațiile biomedicale. Datorită faptului că eliminarea metalului durează, se recomandă scăderea cantității de inițiator prin folosirea unui alcool drept co-inițiator.

Amidonul, fie în starea sa nativă, fie modificat a fost un subiect de studiu intens de-a lungul anilor. Odată cu creșterea interesului în domeniul biomedical și farmaceutic asupra polimerilor biodegradabili ca matrici pentru sistemele de eliberare controlată, au fost publicate numeroase articole asupra modificărilor polimerilor naturali.

Kost și Shefer 195 au studiat două metode de formare a rețelelor în vederea înglobării de medicament în matricea amidonului pentru utilizarea lor în cadrul sistemelor de eliberare controlată. Deoarece degradarea enzimatică a amidonului are loc atât în strucura sa cât și în cadrul morfologiei, gradul de degradare, până la eliberarea medicamentului, va fi afectat și va depinde de structura și rețeaua formată.

Deși folosit de secole, amidonul continuă să fie un material brut abundent, necostisitor, biodegradabil și care permite într-un mod facil realizarea de modificări chimice. Mai mult, este important faptul că moleculele de amidon sunt multifuncționale, având trei grupări hidroxil pe unitatea glucozidică, care sunt în general accesibile pentru transformarea grupărilor OH tipice primare și secundare 196 .

Poliesterii alifatici biodegradabili acoperiţi terminal cu molecule de zahăr au fost intens studiaţi pentru utilizarea loc în aplicaţii biomedicale, în special pentru sistemele de nanoîncapsulare destinate eliberării de medicamente.

O abordare diferită în sinteza copolimerilor grefaţi pe bază de amidon prin polimerizarea în situ este reprezentată de polimerizarea cu deschidere de ciclu (ROP) a monomerului ε-caprolactonă în prezenţa polizaharidei.

În această reacţie, grupările hidroxil ale amidonului se presupun a funcţiona ca situri de iniţiere. Studii anterioare au arătat că catalistii comuni pentru ROP, cum e cazul ţin octoatului sau a isopropoxidului de aluminiu, au dus la eficiente de grefare scăzute (0-14%) 197 . Amidonul este un material foarte hidrofilic ce are mereu un grad de umiditate. Apa din granulele de amidon concurează cu grupările hidroxilice ale amidonului în etapa de iniţiere a reacţiei de polimerizare, ducând la formarea de homopolimeri PCL, în loc de amidon-g-PCL, rezultând astfel valori mici ale eficienţei de grefare. O altă cauză pentru aceste valori scăzute este natura eterogenă a reacţiei.

Amidonul este insolubil în solvenţii organici tipici folosiţi pentru ROP (cum ar fi toluenul sau THF) şi prezenţa unui sistemu de reacţie lichid-solid duce la o reducere a ratei reacţiei dintre amidon şi ε-caprolactonă. Cea mai mare valoare a eficienţei de grefare (90%) a fost obţinută când s-a folosit trietilaluminiu drept catalist 198 , care, cu toate acestea, este extrem de sensibil la apă şi aer şi dificil de manipulat deoarece eliberează etan în timpul reacţiei, un produs rezidual foarte inflamabil.

Acest capitol descrie studiul experimental al ROP ε-caprolactonei în prezenţa amidonului.

IV.2.1.1. Analiza structurală

IV.2.1.1.1.Caracterizarea prin spectroscopie FTIR

Picurile de PCL caracteristice 199 (3300 -3700, 1737, 1725, 850-1480, şi 720) cm -1 apar în spectrele FIR, alături de absorbanţa largă a grupărilor O-H de 3200-3700 cm -1 . Rezultate similare au fost raportate şi în alte surse 200 . Figura următoare surprinde intensitatea vibraţiilor grupării -C=O ca bandă largă la 1731 cm -1 în spectrul PCL/amidon, un rezultat similar celui obţinut de Wang şi colab 201 . Pentru a afla nr de moli de caprolactonă grefată în poziția 2 sau 3 se procedează în felul următor:

NG 2,3 = H αb = 0.0284/2 = =6.6*10 -3 , adică 0.066 grefe în poziția 2 sau 3 pentru 100 de unități de amidon.

NG 6 =NG-NG 2,3 = 0.083-0.066=0.017 grefe în poziția 6.

Cu toate că NG 2,3 a fost deosebit de NG 6 , gradul de polimerizare nu s-a putut calcula separat pentru fiecare grefă de PCLdeoarece toate unitățile principale de CL de pe ramurile C 2 -și C 3 -și C 6 -au arătat deplasări chimice similare în spectrul RMN. Totuți gradul de polimerizare relativ a fost calculat din ecuația GP=N CL /NG, ca fiind 0.98.

Tabel 8. Deplasările chimice 13 C și 1 H pentru copolimerul SPCL2.

IV.2.1.2. Analiza termică

De-a lungul ultimilor decenii, s-au realizat numeroase studii privind dezvoltarea polimerilor biodegradabili, amestecurile de polimeri și compozite folosind amidonul. Amestecurile amidon-PCL își găsesc locul în diverse studii de literatură dar obținerea lor comercială nu este foarte populară datorită prețului ridicat și a variațiilor ce apar în proprietățile lor mecanice.

Aceste studii au arătat ca proprietățile mecanice ale amestecului amidon/PCL devin slabe odată cu creșterea conținutului de amidon. Acest fapt se datorează incompatibilității dintre amidonul hidrofilic și PCL hidrofobic, precum și adeziunii interfaciale scăzute dintre cei doi compuși. Structura moleculară a amidonului este complicată. Cu toate acestea, numeroase investigații au fost realizate pentru a stabili nivelul de organizare din interiorul granulelor de amidon, cum ar fi difracția cu raze X, microscopia de forță atomică și cea cu transmisie de electroni.În forma nativă a amidonului, moleculele de amiloză și amilopectină sunt organizate în granule sub formă de straturi alternante semi-cristaline și amorfe. Stratul semi-cristalin constă din regiuni ordonate de helixuri duble formate de ramificațiile scurte ale amilopectinei.Regiunile amorfe ale straturilor semi-cristaline și ale straturilor amorfe sunt compuse din amiloză și ramuri neordonate de amilopectină 205,206 . Cele două forme nu pot fi evidențiate prin DSC deoarece au valori similare pentru temperatură și entalipa de topire/decomplexare.

Temperatura și parametrii de entalpie au fost calibrați folosind topirea indiumului (Tm=156.6 °C , = 28.45 J/g). Pentru valorile acestor doi parametri, majorările indică o formare crescută a cristalelor, iar descreşterile au loc odată cu sporirea conţinutului de amidon. O altă potenţială cauză se regăseşte în caracterul hidrofil al amidonului, ce ar putea determina o adeziune slabă cu PCL-ul hidrofob. Fenomele similare au fost identificate şi de către Averous şi colab. 207 , care au studiat proprietăţile amidonului termoplastic şi amestecurile acestuia cu policaprolactona. Tabelul redă faptul că T m şi ΔHf au scăzut odată cu majorarea conţinutului de PCL/amidon. Reducerea lui T m se datorează vâscozităţii inferioare a amidonului, comparativ cu cea a PCL 208 . Măsurătorile de flux de căldură și temperatura de tranziție sunt căi de obținere a unor informații calitative și cantitative despre proprietățile unor compuși diverși. Proprietățile de amestecare ce pot fi prezise din măsurătorile DSC includ gradul de miscibilitate, gradul de interacțiune intermoleculară și gradul de cristalizare. Nu a fost nici o deplasare semnificativă în ceea ce privește T g -ul PCL în amestesc indicând că structura cristalină a poliesterului nu este afectată de metoda de polimerizare cu amidonul.

Proprietățile fizice ale amidonului sunt influențate de raportul amiloză/amilopectină. În timpul gelatinizării, granulele de amidon se umflă și formează particule de gel. În general, granulele umflate sunt bogate în amilopectină, în timp ce amiloza liniară difuzează în afara granulelor și realizează faza continuă din exteriorul acestora. Termenul de retrogradare este folosit pentru a descrie schimbările ce au loc în timpul răcirii și depozitării amidonului gelatinizat. Apariția cristalinității în gelurile de amidon este atribuită gelatinizării și cristalizării fracției de amiloză.

Rezultatele DSC indică că creșterea procentajului de PCL în compus rezultă într-o creștere a valorii temperaturii de topire, în timp ce cea de cristalizare a scăzut, comportament așteptat, datorită T g -ului mare din structura amorfă a amidonului versus structura semi-cristalină a PCL. Deoarece tranziția vitroasă este măsura mobilității moleculare, o valoare scăzută a acesteia indică o structură mai puțin compactă de amidon în prezența PCL.

Acest fapt este un alt indiciu al unei forme de interacție dintre cei doi polimeri. ΔH m și ΔH c din acești copolimeri au arătat o descreștere liniară odată cu creșterea concentrației de amidon.

Atât din spectrele FT-IR și RMN, cât și in DSC s-a vazut o creștere a intensității pic-ului corespunzător caprolactonei pentru proba SPCL2, ceea ce a dovedit o bună corelare a acestor analize.

IV.2.1.3. Analiza suprafeței prin XPS și Tof-Sims

Reziduurile datorate procesului de sinteză au fost identificate cu ajutorul XPS-ului si a Tof-Sims-ului. Astfel, prin XPS s-au detectat alcoizii de aluminiu generați in situ în urma reacției grupărilor -OH ale amidonului cu AlEt 3 .

Figura 29. Studiul XPS pentru proba SPCL2.

Procentajul atomic (%) al elementelor detectate în suprafața atât a amidonului de plecare cât și a celui modificat cu caprolactonă sunt prezentate in tabelul 11. Cu cât este mai mică valoarea pentru probele analizate comparativ cu valoarea DMSO-ului cu atât produșii sunt mai hidrofobi, analiză corelată și cu gradul de substituție obținut din analiza XPS.

IV.3. Concluzii

o Amestecurile polimerice și asocierile chimice, sub formă de copolimeri bloc sau grefaţi între amidon și poliesterii alifatici, cum e cazul poli(-caprolactona), prezintă un interes deosebit din punctul de vedere al obținerii unor noi materiale biodegradabile.

o S-a realizat reacţia de grefare a amidonului prin polimerizarea cu deschidere de ciclu a εcaprolactonei.

o În această reacţie, grupările hidroxil ale amidonului funcţionează ca situri de iniţiere.

o Cataliștii comuni pentru ROP, cum e cazul ţin octoatului sau a isopropoxidului de aluminiu, duc la eficiente de grefare scăzute (0-14%).

o Picurile âPCL caracteristice (3300 -3700, 1737, 1725, 850-1480, şi 720) cm -1 apar în spectrele FIR, alături de absorbanţa largă a grupărilor O-H de 3200-3700 cm -1 .

o Determinarea compoziției copolimerului s-a realizat prin RMN plecând de la intensitățile semnalelor pentru caprolactonă și pentru unitățile structurale ale amidonului.

o Eficienţa grefării este dificil de determinat în cadrul acestui sistem prin tehnici de analiză standard, cum ar fi RMN-ul, datorită solubilităţii scăzute a produşilor în solvenţii organici standard.

o Proprietățile mecanice ale amestecului amidon/PCL devin slabe odată cu creșterea conținutului de amidon. Acest fapt se datorează incompatibilității dintre amidonul hidrofilic și PCL hidrofobic, precum și adeziunii interfaciale scăzute dintre cei doi compuși.

o Se observă ca în cazul acestor compuși avem picuri distinctive deoarece cristalizarea polimerului este distribuită uniform, fapt ce duce la topirea mai lentă a unor componente.

De asemenea, existența ramificațiilor și sub-ramificațiilor contribuie la apariția diferitelor pante în punctul de topire, iar diferitele aranjamente și greutăți moleculare ale polimerului pot schimba modul cum aceste pante apar în profilul DSC.

o Pentru fiecare copolimer sunt observate două endoterme distincte în ceea ce privește fenomenul de topire, fapt ce indică o fază de separare clară între domeniile hidrofobic și hidrofilic, atât punctul de topire, T m , cât și căldura de topire (ΔH f ) sunt afectate de greutatea lor moleculară.

o Prezența componentei amorfe AGU poate influența într-un mod puternic comportamentul ratei de cristalinizare al PCL prin faptul că acest component are un T g mai mare decât temperatura onset de cristalizare a PCL. Acest fapt ar duce la o descreștere a ratei de cristalinizare, în special atunci când conținutul compusului amorf crește.

o Reziduurile datorate procesului de sinteză au fost identificate cu ajutorul XPS-ului si a Tof-Sims-ului. Hidrogelurile au fost pregătite după următoarea procedură generală: la o soluţie polimerică de 12% amidon (0.3 g, 1.85 mmol) a fost adăugată o cantitate determinată de soluție NaOH 1N și s-a realizat o agitare mecanică de cel puțin 10 minute.NaOH a fost folosit într-un raport masic față de epiclorhidrină de 1:1. Înainte de a adăuga agentul de reticulare, se elimină aerul prezent sub formă de bule cu ajutorul unei bai cu ultrasunete. Se adaugă agentul de reticulare, se omogenizează timp de 1 oră, după care amestecul se depune între două plăci de sticlă, la etuvă pentru un timp corespunzător programului experimental. Filmele se imersează în apă distilată pentru îndepărtarea compușilor nereacționați, cu schimbarea acesteia până ce pH-ul apei de spălare acoincis cu cel al apei distilate și se continuă cu imersarea în acetonă a hidrogelului până când toată apa este înlocuită.

CAPITOLUL V OBȚINEREA HIDROGELURILOR PE BAZĂ DE AMIDON

Terminologia folosită în cele ce urmează este următoarea: HS-hidrogel pe bază de amidon nemodificat, HAPg-hidrogel pe bază de amidon modificat prin introducerea de triple legături. Reacția amidonului cu EPCl duce la formarea de digliceroli ai amidonului, care sunt foarte rezistenţi la pH şi la tensiuni mecanice datorită formării legăturilor eterice dintre reticulări şi grupările hidroxil din polizaharid.

Figura 1. Gradul de umflare maxim (SD) pentru hidrogelurile obținute în urma varierii a. cantității de agent de reticulare, b. temperaturii, c. timpului de reticulare.

Se observă din reprezentările gradelor de umflare că acestea cresc odată cu scăderea cantității de agent reticulant și scad odată cu creșterea temperaturii de reticulare.

Pentru probele pe bază de amidon hidrofobizat prin introducerea triplelor legături pe lanțul său sa observat un grad de umflare mai scăzut comparativ cu cel al amidonului nemodificat. Și în cazul acestor compuși, este evidentă dependența capacității lor de retenție a apei, de cantitatea de agent reticulant, durata și timpul de reticulare.

a. b. Imaginile SEM ale amidonului propargilat reticulat cu epiclorhidrină și acid citric au arătat structuri asemănătoare, poroase cu mici diferențe. Astfel, hidrogelul reticulat cu acid citric a prezentat o structură deosebit de uniformă, cu pori de dimensiuni apropiate, mai mici de 50μm.

Hidrogelul reticulat cu EPCL, în schimb are pori de dimensiuni mai mici de 10μm însă aceștia nu sunt distribuiți la fel de uniform ca în exemplul de mai sus.

V. Spectrul FT-IR al hidrogelurilor pe baza de amidon funcționalizat cu grupare de tip alchină prin reacția cu PCLN 3 via click chemistry, notate cu HCC, a arătat ca și în cazul reacției amidonului propargilat cu poliesterul, benzile caracteristice lanţurilor de PCL prin prezenţa grupărilor esterice la 1733 cm -1 . S-a remarcat însă și un pic mic corespunzător grupării azidice datorită prezenței PCLN 3 nereacționat în ochiurile hidrogelului.

V.2.2.4. Analiza termică

Stabilitatea termică a copolimerilor a fost evaluată folosind analiza termogravimetrică (ATG). Degradarea termică a policaprolactonei a fost studiată de mulți cercetători, Persenaire și colab. 212 propunând un mecanism de degradare în două etape, mai întâi prin ruperea la întâmplare a lanțului de PCL printr-o reacție de piroliză, urmată de formarea ε-caprolactonei ca rezultat al scindării în urma procesului de degradare 213 . Aoyagi și colab. 214 au propus un mecanism de degradare într-o singură etapă, în care polimerul se degradează prin îndepărtarea specifică a monomerului de la grupările terminale. Așadar, mecanismul de degradare termică a PCL este ambiguu și controversat 215 . Figura 8 arată curbele de pierdere masică pentru hidrogelul pe bază de amidon propargilat, pentru PCL și pentru produsul final, obținut via "click chemistry" între polimerii menționați mai sus. Temperatura inițială de degradare a PCL este mai mică în copolimerul final față de polimerul simplu. PCL se degradează într-o singură etapă (în jurul valorii de 400 °C) implicând manifestarea simultană a două tipuri de reacție, și anume scindarea aleatorie a lanțului și desfacerea hidroxilului terminal, ducând la formarea ε-caprolactonei 216,217 . Figurile de mai jos arată că degradarea celor doi polimeri este neuniformă. Figura 8a. arată termograma ATG a hidrogelului pe bază de amidon propargilat. De menționat ca această curbă este similară cu cea a amidonului nativ, dar proprietatea sa termică a fost afectată în direcția îmbunătățirii cu 20 °C a temperaturii de degradare. Descompunerea nu a fost completă până când temperatura nu a ajuns la 600 °C .

V.3. Concluzii

o S-au obținut hidrogeluri pe bază de amidon și amidon modificat, reticulate atât cu epiclorhidrină cât și cu acid citric.

o S-a grefat prin procedeul click chemistry, PCLN 3, pe hidrogelurile pe bază de amidon modificat cu triple legături.

o În urma grefării s-a remarcat în spectrul FT-IR un pic mic corespunzător grupării azidice datorită prezenței PCLN 3 nereacționate în ochiurile hidrogelului.

o Prezența inelului triazolic din spectrul RMN 1 H HR-MAS a confirmat de asemenea reușita reacției.

o S-au realizat amestecuri de diferite concentrații apă/DMF în încercarea de a scoate PCL nereacționat, prins în rețeaua hidrogelului, ieșirea lanțului hidrofobic din ochiurile hidrogelului fiind facilitată de proporția mai mare a DMF-ului din amestec.

V.3. Obținerea hidrogelurilor pe bază de amidon prin reticulare cu acid citric

Amidonul nativ nu este potrivit pentru a fi utilizat ca sistem de eliberare medicamentoasă controlată, din cauza curgerii și compresibilității modeste și, cel mai important, daorită proprietăților de eliberare rapidă ce rezultă din umflarea substanțială în medii apoase, alături de degradarea enzimatică accelerată prin α-amilază în fluide fiziologice. Pentru a depăși aceste limitări și pentru a extinde domeniul aplicativ al amidonului ca exponent al eliberării susținute de medicamente, proprietățile acestuia pot fi configurate prin modificări fizice (retrogradare) și chimice (reticulare) sau prin hidroliză enzimatică (dextrine).

Mecanismul și randamentul de eliberare a medicamentului dintr-o matrice polimerică hidrofilă poate depinde de permeabilitatea apoasă, de umflarea polimerului, dizolvarea și difuzia medicamentului și de eroziunea matricii 218 . Acești factori pot afecta structura și rezistența rețelei gelului, din cauza proprietăților fizice ale polimerului în sine, a interacțiunilor lanț-lanț, respectiv lanț-solvent a polimerului. Amidonul conține două tipuri de hidroxili: primar (6-OH) și secundar (2-OH și 3-OH). Aceștia sunt capabili de a reacționa cu reactivi multifuncționali, rezultând amidonuri reticulate. Reticularea este realizată cu scopul restricționării umflării granulei de amidon în condiții de gătire, sau pentru a preveni gelatinizarea. Reactivii acceptați de către FDA 219 pentru obținerea de amidon reticulat de calitate alimentară sunt clorura de fosforil, trimetafosfatul de sodiu, anhidrida acetică adipică mixtă şi amestecuri de trimetafosfat de sodiu şi tripolifosfați. Epiclorhidrina nu mai este utilizată de către producătorii de amidon (SUA) deoarece clorohidrinele sunt agenți cancerigeni. Acidul citric este cunoscut ca fiind nedăunător în comparație cu alte substanțe folosite în acest scop și rata de digestie de pancreatină scade odată cu creșterea gradului de substituție (DS) în citratul de amidon 220 .

Cele două stadii ale reacției dintre amidon și acidul carboxilic constau mai întâi dintr-o atașsare a acestuia via procedeul de esterificare cu gruparea hidroxilică și reacția acesteia mai departe, tot via esterificare, cu altă grupare hidroxilică a amidonului, producând astfel reticulîri ale polizaharidei. Diverși autori au propus un mecanism bazat pe formarea intermediară a anhidridei. Atașarea acidului carboxilic la polimer prin esterificare reacția a primului ciclu anhidridic ar expune o nouă unitatede acid în acidul citric care are conectivitatea chimică exactă penru a forma o un nou compus intra molecular anhidridic cu unitate adiacentă de acid carboxilic. Reacția următoare cu eterul amidonului poate conduce la reticulare. Datorită implicării grupărilor hidroxilice ale amidonului în legătura esterică, reticularea acestui polimer hidrofilic s-a realizat pentru a limita afinitatea acestuia către apă. Substituția amidonului în stare granulară este cu precădere întâlnită în regiunea amorfă, deoarece reactivii pot penetra mai ușor aceste zone. Stabilitatea termică a citratului de amidon are legătură cu conținutul de amilopectină și/ sau structura amidonului. Așadar, citratul de amidon cu un conținut mai mare de amilopectină poate fi mai stabil termic decât cel cun conținut scăzut. Odată cu introducerea citratului, structura granulară este alterată. Substituientul citrat poate altera asocierile dintre amiloză și amilopectină și fiecare component cu el însuși în granule, ceea ce va împiedica umflarea granulelor de amidon.

V.3.1. Principiul reacției

Schema 3. Mecanismul reacţiei de reticulare cu acid citric.

În studiul aici de față, hidrogelul pe bază de amidon reticulat cu acid citric (HS) a arătat 10 pic-uri în regiunea 3700-800 cm -1 . Din studii anterioare, Irudayayaraj și Yang au arătat că absorbanța la 3381 și 2931 cm -1 poate fi atribuit grupării O-H și C-H. Absorbanța de la 1350 cm - 1 a fost atribuită grupărilor O-C-H, C-C-H și C-O-H. Absorbanțele de la 1150 și 1080 cm -1 sunt atribuite amândouă cuplării C-O, C-C respectiv O-H. Absorbanța de la 1022 cm -1 este atribuită vibrației C-O-H iar cele de la 930 și 860 cm -1 sunt corespunzătoare pentru deformarea C-H.

Un nou pic la 1724 cm -1 a fost prezent în toate hidrogelurile reticulate nu și în amidonul de plecare. Acest nou pic poate fi atribuit grupării esterice caracteristice din acidul citric prezente în structura produșilor reticulați.

Granulele de amidon nativ, prezintă o cristalinitate parțială cu un grad de cristalinitate de 20-40 % 221 . Pentru a investiga această proprietate de obicei se folosește difractrometria cu raze X, dar s-au raportat rezultate în această direcție și folosind FT-IR. Banda de absorbție IR la 1074 cm -1 este sensibilă la structura cristalină sau ordonată, iar banda de la 1020 cm -1 este asociată cu structura amorfă din amidon. Astfel, raportul dintre intensitatea benzilor de la 1020 cm -1 /1074 cm -1 poate exprima gradul de ordine din amidon 222 . Valorile mai ridicate indică faptul că în amidonul de plecare a existat o fază amorfă mai mare. Creșterea în intensitate a benzii de la 1724 cm-1 indică faptul că mai multe grupări esterice au fost prezente în amidon prin legătura covalentă între acidul citric și moleculele polizaharidei. Raportul de mai sus a crescut odată cu gradul de substituție fapt ce a indicat că substituienții citrați au alterat împachetarea lanțului și a generat structuri mai amorfe în amidon. Pic-urile caracteristice ale PCL, 3300-3700, 1735 (C=O din ε-CL),1725, 850-1480 și 720 cm -1 , toate apar în ambii polimeri, un extra pic s-a observat pentru PCL modificată la 1722 cm -1 , specific pentru -C=O, la 2871 cm -1 este vibrația simetrică -CH 2 -din ε-CL, iar la 2956 cm -1 valoarea corespunzătoare vibrației asimetrice.

V.3.3.2. Analiza morfologică

Imaginile SEM ale probelor liofilizate sunt prezentate în figura de mai jos. Morfologia celor trei tipuri de hidrogeluri este în concordanță cu hidrofilia lor. Hidrogelul pe bază de amidon nemodificat, capabil să rețină cantități mari de apă, va forma prin liofilizare un material cu porozitate neuniformă, dar cu pori mai mari (Fig. 13A).

Reducerea hidrofiliei amidonului prin estericare cu CP sau prin grefarea de PCL va conduce la reținerea unor cantități mai mici de apă cu formarea în urma liofilizării a unor materiale cu distribuție relativ uniformă a porilor și a dimensiunii mai reduse ale acestora. Din acest punct de vedere morfologia celor două tripuri de hidrogeluri este asemănatoare, cele pe bază de amidon modificat cu CP prezentând pori mai numeroși decât cele pe bază de amidon grefat cu PCL.

Morfologia atestată de micrografiile SEM ale celor trei materiale este în concordanță cu capacitatea lor de a reține apă care scade în seria HS >HSCP> HSPCL. A Figura 13. SEM pentru HS(A), HSPCL(B), HSCP(C).

V.3.3.3. Analiza rezultatelor privind proprietățile de umflare în soluții apoase

Capacitatea hidrogelurilor obţinute de a absorbi apa se datorează prezenţei grupărilor hidrofilice rămase libere în polimerul ce formează structura acestor sisteme. Datorită contribuţiei acestor grupări în reţea, polimerul este astfel hidratat la diferite grade, în funcţie de compoziţia hidrogelului . Capacitatea hidrogelurilor obținute de a absorbi apă se datorează prezenței grupărilor hidrofile din polimerii ce formează structura hidrogelului.

Datorită contribuției acestor grupări în rețea, polimerul va fi hidratat la grade diferite în funcție de compoziția hidrogelului. Caracteristica principală a hidrogelurilor este comportamentul la umflarea în apă, mediu în care structura lor finală este dezvaluită. Pentru aplicațiile farmaceutice,

C B A

este important a se cunoaște cinetica de umflare a hidrogelurilor deoarece este un proces direct legat de includerea de medicamente și de eliberarea acestora.

Retenția apei în raport cu timpul a fost obținută prin îndepărtarea periodică a probelor din apă, uscarea lor rapidă cu o hartie filtru și cântărirea lor din nou. Absorbția apei de către hidrogelurile inițial uscate a fost urmarită până ce acestea au atins un grad de umflare maximal, curbele fiind reprezentate în figurile 14 și 15. Figura 14. Cineticille gradului de umflare pentru hidrogelurile for HS, HSCP and HSPCL cu raport molar -OH primary/CA variat (T=50°C).

S-a observat că, iniţial, rata de absorbţie a apei creşte brusc şi apoi începe să se stabilizeze. Gradul de absorbţie a apei de hidrogeluri a fost saturat în 4 ore. Măsurătorile gradului de umflare au arătat că absorbţia de apă este mai mare atunci când valoarea cantității de CA este scăzută.

Hidrogelurile cele mai umflate sunt cele pe bază de amidon nemodificate. Deşi în teorie HSCP este mai hidrofob decât HSPCL, gradul de umflare a dovedit contrariul. O posibilă explicaţie este legată de canalele de distribuţie a PCL în jurul amidonului, acoperindu-l cu un strat hidrofob. În plus, prezenţa de grupări terminale -OH ar putea fi, de asemenea, implicate in reacția de reticulare, deşi concentraţia lor este mai mică cea a unităţilor de amidon. Lanţurile de palmitoil, chiar dacă sunt mai lungi, distribuţia de tip pieptene şi DS-ul scăzut le permite să acţioneze ca o reţea mai hidrofilă decât cea pe bază de PCL. Având în vedere că scopul acestor hidrogeluri a fost acela de imobilizare şi de eliberare de medicamente, am încheiat cercetările cu includerea de levofloxacină (Schema 2) şi urmărirea cineticii sale de eliberare. Au fost încărcate trei tipuri de hidrogeluri, cinetica de eliberare constatându-se ca fiind ca cea a sistemelor difuzionale tipice. În primele momente ale procesului se înregistrează o creștere rapidă a cantității de medicament eliberat,"burst effect", fenomen datorat faptului că se eliberează medicamentul de la suprafață, din pori și are o acțiune benefică constituind o primă concentrație de atac. Apoi, evoluția cinetică indică o eliberare mai lentă a medicamentlui din structura hidrogelului. Cantitatea de medicament eliberată scade odată cu creşterea gradului de reticulare, dar este determinată, de asemenea, și de cantitatea de medicament inclusă care variază și ea.

V.3.3.4. Analiza capacității de includere și eliberare a Levofloxacinei

Probele uscate şi cântărite au fost imersate într-o soluţie apoasă de levofloxacin (10 mL, 10% w/w) şi lăsate 48 de ore, includerea constând în difuzia medicamentului în rețea prin reținerea sa în porii materialului. Cantitatea maximă de medicament încărcată în fiecare probă a fost calculată folosind un măsurători de spectrofotometru (lungimea de undă pentru levofloxacin folosită pentru detecţie a fost 300 nm) după cum urmează:

V C m m f L I L    , ecuația (1)
 m Llevofloxacin încărcat (mg)  m I -cantitatea iniţială de levofloxacin (mg)  C Lfconcentraţia de levofloxacin în soluţia rămasă de medicament după îndepărtarea probei, calculată din curba de calibrare pentru levofloxacin în apă (mg/mL)  V -volumul soluţiei de medicament rămas (m L ).

Eliberarea levofloxacinei din hidrogeluri

Probele încărcate cu levofloxacin au fost imersate în flacoane acoperite ce conţin 100 mL de soluţie tampon, pH=7.4. PBS-ul a fost ales deoarece se doreşte utilizarea hidrogelurilor întrun mediu biologic, iar concentraţia ionilor din soluţie se armonizează cu cea a corpului uman.

Studiile de eliberare a medicamentului au fost realizate la 37°C într-o baie de apă cu agitare, GFL 1092 la 60 rpm, timp de 72 ore. Procesul de eliberare a levofloxacinei din hidrogeluri a fost monitorizat cu un spectrofotometru UV-VIS NanoDrop, (Nanodrop ND-1000) de la Thermo Scientific. Rezultatele reprezintă valoarea medie a trei determinări.

Levofloxacina eliberată a fost calculată folosind ecuația curbei de calibrare și greutatea fiecărei probe, după cum este descris mai jos: unde, m L , este cantitatea de levofloxacină eliberată, C Lf este concentrația calculată pornind de la curba de calibrare a levofloxacinei(A Lf = C LF  7,048) (mg / ml) și m S reprezintă greutatea probei (g).

Levofloxacina, un medicament solubil în apă, se eliberează imediat când este în contact cu mediul de dizolvare aşa cum se vede în cazul hidrogelurilor pe bază de amidon (HS). Hidrogelurile cu lanţuri de PCL au susținut eliberarea levofloxacinei pentru mai mult de şapte ore, cu o cinetică liniară de susținută, în timp ce produșii pe bază de palmitoil, ocupă locul al doilea, cu un interval de timp mai scurt. Examinarea cineticii de eliberare in vitro a levofloxacinei de către hidrogelurile pe bază de HSPCL au fost corelate cu comportamentul de umflare şi s-a constatat că matricile pe bază de PCL au avut proprietăţi îmbunătăţite de eliberare susţinută, comparativ cu hidrogelurile pe bază de HS şi HSCP. După eliberarea medicamentului de la suprafața, eliberarea levofloxacinei a devenit mai lentă, deoarece polimerii hidrofobi împiedică penetrarea mediului de dizolvare în reţeaua de hidrogel.

La nivel hidrofob superior (cum e în cazul HSPCL), rata de eliberare a medicamentului a fost redusă în mod semnificativ ca urmare a porozității reduse a matricei, dar a crescut eliberarea. Hidrogelurile cu concentraţii mai mici de CA prezintă o cinetică mai rapidă de eliberare, în timp ce hidrogelurile obținute prin reticularea la o durată mai scurtă de timp, susțin eliberarea de medicamente aşa cum se vede în tabelul de mai jos:

Tabelul 4. Influența duratei de reticulare asupra timpului maxim al eliberării celei mai mari cantități de medicament (notat cu T e ). Descrierea matematică a procesului de eliberare este dificilă de realizat, datorită caracteristicilor fizice care trebuie luate în considerare, ca difuzia apei în hidrogel, umflarea matricii, difuzia medicamentului din rețea, dizolvarea polimerului, porozitatea, compoziția și schimbările în dimensiunea rețelei.

Fiecare model are caracteristicile sale datorită acestor presupuneri și aplicabilității respectivelor modele se restricționează pentru anumite sisteme medicament-polimer.

Pentru descrierea cineticii de eliberare in vitro a principiilor active se folosesc anumite modele matematice, iar pentru acest studiu s-au ales ecuațiile lui Lagergren de ordin întâi și a lui Ho, pseudo de ordin doi. Ecuația empirică a lui Lagergren propusă la sfârțitul secolului XIX pentru a descrie cinetica absorbției la interfața solid/soluție a fost cea mai folosită ecuație de până acum.

Ecuația de ordin 1 a lui Lagergren q t = q e * [1-exp(-k 1 *t)] ecuația (3) unde, q t = cantitatea de medicament absorbită la un anumit timp t (mg/g) q e = cantitatea de medicament absorbită la echilibru (mg/g) k 1 = constanta lui Lagergren (min -1 ) t = timp.

Ecuația de ordinul 2 a lui Ho q t = t*k 2 q e 2 / (1+t*k 2 q e ) ecuația( 4 Figura 18. Fitarea datelor experimentale cu cele trei modele de hidrogeluri, unde F1 înseamnă fitarea după ecuația lui Lagergren, iar F2, fitarea conform ecuației lui Ho.

Se observă o caracteristică comună a tuturor fitărilor: cantitatea de medicament eliberat crește până când atinge un platou. Coeficienții de corelare sunt apropiați de valoarea unității (R ² = 0.99). Aceste corelări (R2) au fost folosite ca indicatori pentru o mai bună fitare a fiecărei ecuații considerate, eliberarea levofloxacinei urmând îndeaproape modelele de ordinul unu și doi. Toate rezultatele sunt în concordanță cu cele din literatură, astfel dovedesc că amândouă modelele cinetice au furnizat o descriere bună a rezultatelor obținute după cum se observă din valorile corelării coeficienților folosiți în cadrul studiului. În orice caz, conform valorilor neglijabile ale R 2 pentru datele de eliberare, se constată că aplicarea acestor modele matematice este pur empirică și nici o concluzie definitivă în ceea ce privește mecanismul dominant de transport de masă, nu poate fi subliniată.

Tabelul 5. Datele eliberărilor modelate după ecuațiile de ordinul 1 a lui Lagergren și de ordinul doi a lui Ho.

Sample code

Lagergren first-order Ho second-order K 1 (min -1 ) R 2 k 2 *10 În ceea ce privește exponentul de eliberare, din modelul Korsmeyer-Peppas obținut și ilustrat în tabelul 7 (n ~ 0.4), se poate sugera că mecanismul ce a dus la eliberarea levofloxacinei a fost un transport de tip Fickian.

V.4.Concluzii

o Au fost obţinute prin reticulare cu acid citric și epiclorhidrină hidrogeluri noi, pe bază de amidon şi amidon hidrofobizat cu lanţuri palmitoil şi PCL.

o Spectrul ATR-IR al hidrogelurilor HSCP a arătat benzile caracteristice pentru amidonul modificat cu clorură de palmitoil.

o Introducerea lanţurilor de palmitoil a fost confirmată de prezenţa grupărilor esterice de tip carbonil (C=O) și de prezența picurilor corespunzătoare grupărilor metil şi metilen asociate substituientilor palmitoilici.

o Gruparea esterică formată în urma reticulării covalente absoarbe într-o zonă în care mai absorb şi alte grupări funcţionale şi de aceea a fost necesară o deconvoluţie spectrală între 1500-1800 cm -1 .

o Vibraţia puternică caracteristică pentru grupările hidroxil din amidonul nativ descreşte în intensitate atât după acilare cât şi după reacţia de reticulare, conform faptului că aceste grupări se diminuează.

o Intensitatea legăturii esterice este mai puternică odată cu creşterea conţinutului de CA în hidrogel.

o Pic-urile caracteristice ale PCL apar atât în polimerul grefat cât şi în cel reticulat. o S-a realizat o deconvoluţie pentru a dezvălui picul punții esterice caracteristice reticulării.

o Morfologia celor trei tipuri de hidrogeluri este în concordanță cu hidrofilia lor.

o Hidrogelul pe bază de amidon nemodificat formează prin liofilizare un material cu porozitate neuniformă, dar cu pori mai mari.

o Reducerea hidrofiliei amidonului prin estericare cu CP sau prin grefarea de PCL conduce la materiale cu distribuție relativ uniformă a porilor și cu o dimensiuni mai redusă a acestora.

o Gradul de absorbţie a apei de hidrogeluri a fost saturat în 4 ore.

o Măsurătorile gradului de umflare au arătat că absorbţia de apă este mai mare atunci când valoarea cantității de CA este scăzută.

o Au fost încărcate trei tipuri de hidrogeluri, cinetica de eliberare fiind cea a sistemelor difuzionale tipice.

o Se înregistrează o creștere rapidă a cantității de medicament eliberat,"burst effect", fenomen datorat faptului că se eliberează medicamentul de la suprafață, din pori și are o acțiune benefică constituind o primă concentrație de atac.

o Cantitatea de medicament eliberată scade odată cu creşterea gradului de reticulare, dar este determinată, de asemenea, și de cantitatea de medicament inclusă care variază și ea.

o Hidrogelurile cu lanţuri de PCL au susținut eliberarea levofloxacinei pentru mai mult de şapte ore, cu o cinetică liniară de susținută, în timp ce produșii pe bază de palmitoil, ocupă locul al doilea, cu un interval de timp mai scurt.

o Examinarea cineticii de eliberare in vitro a levofloxacinei de către hidrogelurile pe bază de HSPCL au fost corelate cu comportamentul de umflare şi s-a constatat că matricile pe bază de PCL au avut proprietăţi îmbunătăţite de eliberare susţinută, comparativ cu hidrogelurile pe bază de HS şi HSCP.

o După eliberarea medicamentului de la suprafața, eliberarea levofloxacinei a devenit mai lentă, deoarece polimerii hidrofobi împiedică penetrarea mediului de dizolvare în reţeaua de hidrogel. La nivel hidrofob superior (cum e în cazul HSPCL), rata de eliberare a medicamentului a fost redusă în mod semnificativ ca urmare a porozității reduse a matricei, dar a crescut eliberarea.

o Hidrogelurile cu concentraţii mai mici de CA prezintă o cinetică mai rapidă de eliberare, în timp ce hidrogelurile obținute prin reticularea la o durată mai scurtă de timp.

o Pentru descrierea cineticii de eliberare in vitro a principiilor active s-au folosit modelele matematice, ale lui Lagergren de ordin întâi și a lui Ho, pseudo de ordin doi.

o Se observă o caracteristică comună a tuturor fitărilor: cantitatea de medicament eliberat crește până când atinge un platou.

o Coeficienții de corelare sunt apropiați de valoarea unității (R ² = 0.99).

o Toate rezultatele sunt în concordanță cu cele din literatură, dovedind că amândouă modelele cinetice au furnizat o descriere bună a rezultatelor obținute după cum se observă din valorile corelării coeficienților folosiți în cadrul studiului.

o Datele obținute din studiile de eliberare a medicamentului in vitro au fost de asemenea fitate și după modelul Korsmeyer-Peppas.

o În ceea ce privește exponentul de eliberare, din modelul Korsmeyer-Peppas obținut n ~ 0.4, se poate sugera că mecanismul ce a dus la eliberarea levofloxacinei a fost unul de tip Fickian.

Concluzii generale

o Am obținut polimeri cu hidrofilie controlată prin esterificarea cu clorura de palmitoil;

o Gradul de substituție a fost calculat cu ajutorul analizei XPS dupa cum a fost descris anterior, ca fiind raportul dintre suprafata pic-ului (-O-C-O) ce corespunde esterului și aria pic-ului -O-C-O din unitatea glucozidică.

o S-a obținut un grad ridicat de substituție pentru concentrații mari ale clorurii acide și pentru timpi de reacție lungi.

o S-a observat că un parametru important în maximizarea gradului de substituție este reprezentat de cantitatea de clorură de palmitoil folosită, pe când timpul este de o importanță minoră, iar temperatura nu are nici o influență în intervalul studiat.

o Imaginile SEM au arătat schimbări semnificative în ceea ce privește morfologia amidonului după reacția sa cu clorura de palmitoil, trecând de la o structură granulară la una poroasă.

o S-a realizat modificarea chimică a amidonului solubil prin introducerea grupării alchine. o S-a sintetizat azido poli (ε-caprolactonei) în două etape: în prima s-a obținut PCL funcționalizată pe capăt cu Br, iar în cea de a doua s-a introdus funcția azidică, terminală.

o Prin spectroscopia 1 H NMR, s-a determinat gradul de polimerizare din intensitățile relative ale pic-urilor ce aparțin lanțului polimeric, H α sau H ε + H ε" și a celor aparținând grupului terminal metilenic H ε" .

o Polimerul PCL-Br de diferite grade de polimerizare (4, 13, respectiv 20) a fost sintetizat prin polimerizarea anionică a ε-caprolactonei, în prezența 11-bromo-undecanol ca agent de transfer și a trietilaluminiului (AlEt 3 ).

o S-au obținut noi copolimeri de tip pieptene, bază de amidon grefat cu PCL prin procedeul "click chemistry" și ROP;

o Introducerea unităţilor de PCL prin "click chemistry" a eliminat unele dezavantaje ale polizaharidei abordate, prin mărirea hidrofobicitatii amidonului şi de asemenea prin creşterea cristalinităţii copolimerului prin varierea lungimii lanţului de PCL;

o Caracterul amfifilic al copolimerului a fost evidenţiat prin capacitatea sa de a forma polimerosomi în soluţii apoase. Copolimerii grefaţi pot fi astfel potenţiali candidaţi pentru a fi folosiţi în diferite aplicaţii biomedicale;

o S-a realizat grefarea prin "click chemistry" a PCL pe scheletul de amidon și cu ajutorul microundelor, timpul de reacţie scăzând de la 24 ore la 60 minute, în funcție de solventul folosit;

o S-a realizat grefarea prin ROP a PCL pe scheletul de amidon Din curbele DSC s-a observat că PCL are o greutate moleculară suficientă pentru a permite lanțului poliesteric să cristalizeze;

o Determinarea compoziției copolimerului s-a realizat prin RMN plecând de la intensitățile semnalelor pentru caprolactonă și pentru unitățile structurale ale amidonului.

o Eficienţa grefării este dificil de determinat în cadrul acestui sistem prin tehnici de analiză standard, cum ar fi RMN-ul, datorită solubilităţii scăzute a produşilor în solvenţii organici standard.

o Proprietățile mecanice ale amestecului amidon/PCL devin slabe odată cu creșterea conținutului de amidon. Acest fapt se datorează incompatibilității dintre amidonul hidrofilic și PCL hidrofobic, precum și adeziunii interfaciale scăzute dintre cei doi compuși.

o Se observă ca în cazul acestor compuși avem picuri distinctive deoarece cristalizarea polimerului este distribuită uniform, fapt ce duce la topirea mai lentă a unor componente. De asemenea, existența ramificațiilor și sub-ramificațiilor contribuie la apariția diferitelor pante în punctul de topire, iar diferitele aranjamente și greutăți moleculare ale polimerului pot schimba modul cum aceste pante apar în profilul DSC.

o Au fost obținute noi hidrogeluri cu hidrofobicitate controlată prin natura agentului de modificare a amidonului precum si prin parametrii de reticulare ai procesului;

o Au fost obţinute prin reticulare cu acid citric hidrogeluri noi, pe bază de amidon şi amidon hidrofobizat cu lanţuri palmitoil şi PCL.

o Acești produși sunt capabili de a încapsula şi de a elibera medicamente la un pH fiziologic, caracteristici ce depind de compoziția lor.

o Proprietăţile de umflare, încărcare şi eliberare a hidrogelurilor pot fi uşor controlate prin ajustarea parametrilor studiaţi; o Procedura de modelare teoretică a difuziei a fost condusă pe baza datelor experimentale şi scopul acesteia a fost de a evalua influenţa condiţiilor de reacţie asupra gradului de umflare şi a cantităţii de levofloxacină eliberate;

o Creșterea concentraţiei de CA şi a timpului de reticulare conduce la o densitate mai mare a rețelei finale, ceea ce conduce astfel la o scădere a retenției apei, respectiv a medicamentului, dar pentru hidrogelurile hidrofobe a fost observată o perioadă mai lungă de eliberare a levofloxacinei.

o S-a constatat că cinetica de eliberare depinde de tipul de material hidrofob din reţea.

o Studiul a ilustrat că este posibil să se obţină hidrogeluri prin combinaţia adecvată a matricilor hidrofobe pentru obținerea unui profil farmacocinetic acceptabil pentru mediul in vitro.

o Eliberarea a fost dependentă de iar modelul propus pentru cinetica de eliberare a fost cel descris de indicii obținuți descriu odifuzie de tip Fikian.

Figura 1 .

 1 Figura 1. Morfologii ale agregatelor blocurilor polimerice în soluţie a) micelă sferică, b) micelă cilindrică, c) veziculă.

Figura 2 .

 2 Figura 2. Parametrii moleculari ai copolimerului bloc. Tabelul 1. Dependenţa morfologiei finale de parametrii moleculari intrinseci. Parametrul de asamblare p Geometria moleculară Morfologie <1/3 Micele sferice 1/3-1/2 Micele cilindrice

Figura 3 .

 3 Figura 3.Structuri micelare a. "crew-cut", b. micelă stea.

  a) Surfactanţi anionici: sufractanţi cu o grupare hidrofobă şi o grupare cap încărcată negativ; b) Surfactanţi nonionici: sufractanţi cu o grupare hidrofobă şi o grupare cap hidrofilă, cu dipol-moment puternic; surfactanţii nonionici nu au încărcare formală; c) Surfactanţi amfoterici: sufractanţi cu o grupare hidrofobă şi o grupare cap hidrofilă, cu o sarcină pozitivă şi una negativă.Pe lângă extinsa gamă de aplicaţii aferente vieţii cotidiene, compuşii amfifili iau, de asemenea, parte în natură -lipidele din membranele celulare. Combinarea părţilor hidrofile (polare) şi hidrofobe (nepolare) marchează proprietăţile amfifile -lanţul hidrofob favorizează faza uleioasă, în timp ce lanţul hidrofil o favorizează pe cea apoasă. Comportamentul surfactanţilor la nivel molecular depinde de lungimile şi flexibilitatea secvenţei hidrofobe.

Figura 4 .

 4 Figura 4. Agregarea surfactanţilor în funcţie de creşterea concentraţiei lor 42 .

Figura 5 .

 5 Figura 5. Forţele superficiale şi din cadrul fazei volumice.

Figura 6 (

 6 Figura 6(a) prezintă sistemul fără prezenţa surfactantului în soluţie, iar 6(b) existenţa acestuia într-o concentraţie sub CMC şi un strat de adsorbţie incomplet la suprafaţa. Figura 6(c) conţine sistemul în punctul CMC, cu o suprafaţă total adsorbită. Pentru concentraţii ce depăşesc CMC, se formează micele în faza volumică.

Figura 6 .

 6 Figura 6. Adsorbția surfactanților la suprafață.Pe parcursul procesului de adsorbţie, tensiunea superficială scade constant, până la atingerea CMC şi formarea unui strat de adsorbţie complet la suprafaţă. La concentraţii ce depăşsesc CMC, tensiunea superficială are o valoare constantă şi nu mai scade, datorită stratului

Figura 8 .

 8 Figura 8. Clasele principale de polimeri sintetici ce conţin grupări zaharidice.

Figura 9 .

 9 Figura 9. Reprezentări specifice pentru a) micele individuale, sferice şi b) reţele conectate de micele sferice.

Figura 1 .

 1 Figura 1. Reacţii ce se încadrează în cerinţele click chemistry 2

Figura

  Figura 2: Natura dipolară a azidei

Figura 4 :

 4 Figura 4 : Ciclu catalitic al unei reacții de tip click în prezența Cu(I)

Figura 7 .

 7 Figura 7. Conversia omogenă a carboxmetil 6-deoxi-6-azidocelulozei cu prima generaţie de dendron propargilpoliamidoamină 120 .

Figura 2 .

 2 Figura 2. Formarea nanoparticulelor bazate pe conjugat de colesterol-pululan, prin auto-agregare în soluţie apoasă 143 .

Figura 1 .

 1 Figura 1. Evoluția absorbanței în funcție de adăugarea iodului în timpul determinării CLI pentru a) blanc, b) amiloză, c) amidon.

  58,7 eV. Softul folosit pentru tratarea spectrelor a fost MultiPak V8.2C, analiza o zona, diamterul fasciculului de raze X = 100 micrometri, factori de sensitivitate C1s -0.314, O1s -0.733. Măsurătorile Tof-SIMS s-au realizat folosind Physical Electronics TRIFT III ToF-SIMS instrument (Physical Electronics, Chanhassen, USA, folosind o sursă de ioni Au + de 22 keV (current ionic de 2nA) pe o suprafață de 300 µm x 300 µm. Sursa de electroni a fost operată la energii scăzute ale acestora pentru a compensa încărcarea. Doza de ioni a fost menținută sub limitele condițiilor statice. Datele au fost normalizate la intensitatea totală minus intensitatea H +/- datorită reproductibilității sale scăzute. Deviațiile medii și cele standard au fost calculate în urma a trei măsurători pe arii diferite ale aceleiași probe II.3.2. Analiza termică -analiza termogravimetrică (ATG) și calorimetria diferențială de baleiaj (DSC) Stabiliatatea termică a copolimerilor a fost investigată cu un echipament TGA Q50 de la firma T.A. Instruments, sub atmosferă inertă (100 ml/min). Toate experimentele au fost realizate în intervalul 20°C-500°C, la o viteză de încălzire de 10°/min.

Figura 2 .

 2 Figura 2. Ecuaţii ce definesc factorul de formă β.

1 .

 1 Mecanismul reacţiei de esterificare a amidonului cu clorură de palmitoil.

  ului. La 1746 cm -1 apare banda C=O a esterului. Semnalele de la 1467 cm -1 și 1414 cm -1 și cele de la 1169-1030 cm -1 sunt atribuite ν C-O-C și ν as C-O-C din scheletul polimerului. Pic-ul δC-H apare la 1377 cm -1 și este corespunzătoare polimerului și lanțului hidrocarbonic al acidului carboxilic.

Figura 2 .

 2 Figura 2. Deconvoluția XPS a pic-ului C1s pentru a. amidon, b. SCP1, c. SCP2, d.SCP3,e. SCP4.

Figura 4 . 2 .

 42 Figura 4. Comparaţie spectre FT-IR a) amidon nemodificat și b) amidon funcționalizat.

Figura 7 .

 7 Figura 7. Spectrul 1 H RMN al PCL-N 3 DP=13

  totală a tubului Schlenk cele 5 g de bromo-undecanol utilizate, se obţine cantitatea de toluen folosită, 33.71 g.

Schema 1 . 1 .Figura 1 .

 111 Figura 1. Spectrul FT-IR pentru a) copolimerul grefat, b) azido-policaprolactonă şi c) amidon propargilat.

Figura 2 .

 2 Figura 2. Spectrul 1 H NMR al CC20.

Figura 4 .

 4 Figura 4 . Deconvoluţia pic-ului C1s pentru a) amidonul nemodificat, b) amidonul propargilat, c) CC4 şi d) deconvoluţia N1s pentru CC4.

Figura 6 .

 6 Figura 6. Modul negativ al spectrului TOF-SIMS pentru A-amidonul propargilat, B -PCLN 3,

Figura 7 .

 7 Figura 7. Spectrul pozitiv Tof-Sims al probelor cu conţinut variat de cupru, purificate a) 5 zile, b) 3 zile, c) 2 zile.

Figura 8 .Figura 9 .

 89 Figura 8. Analiza ATG pentru a) CC20, b) CC13, c) CC4, d) PCL-N 3 DP=13, e) amidon.

Figura 10 .

 10 Figura 10. Pasajele DSC pentru CC13 si PCL-N3 cu DP=13

Figura 11 .

 11 Figura 11. Imagini SEM ale morfologiei interne pentru a) CC4, b) CC13, c) CC20, d) amidon, e) amidon propargilat.

  Figura 14. Imagini obţinute cu microscopul optic pentru micelele C20

Figura 15 .

 15 Figura 15.Distribuţia dimendiunii micelelor pentru CC20

Figura 17 .

 17 Figura 17. Reactorul Discover® LabMate™

Figura 19 .

 19 Figura 19. Comparație spectre RMN 13 C ale reacției "click chemistry" realizată în a) apă/DMF și b) apă/THF.

Figura 20 .

 20 Figura 20 . Spectru RMN13 C pentru MW2 cu un DP PCL = 13. S-a demonstrat că microundele nu pot determina ruperea legăturilor chimice și că energia furnizată sistemului nu determină alinierea moleculelor. Pentru acuratețea rezultatelor, temperatura este măsurată in situ (figura 21).

Figura 21 .

 21 Figura 21. Parametrii de reacţie pe parcursul reacţiei "click chemistry" în a) DMF şi b) THF asistată de MW (-puterea -temperatura --presiunea)

3 .

 3 Mecanismul reacţiei de grefare a amidonului prin polimerizarea cu deschidere de ciclu a ε-caprolactonei.

Figura 23 . 3 .F

 233 Figura 23. Spectrul FT-IR al pentru a) amidon, b) SPCL2, c) SPCL3.

Figura 25 .

 25 Figura 25. Termograma ATG a amidonului nemodificat.

  figura 25, 26 și 27. În tabelul 9 sunt prezentate cele mai importante caracteristici termogravimetrice ale amidonului pur și modificat.

Figura 26 .

 26 Figura 26. Primul ciclu de încălzire de la -50°C până la 100 °C la o rată de 10°C/min

Tabel 11 .

 11 Figura 30. Spectrul TOF-SIMS, modul negativ pentru A-amidon, B și C-SPCL2, respectiv SPCL3

Tabel 1 .

 1 Programul experimental folosit pentru obţinerea hidrogelurilor reticulate cu epiclorhidrină

Figura 2 .

 2 Figura 2. Imagini SEM pentru a. HAPg ret CA * b. HAPg ret EPCL.

Figura 3 .Figura 4 .

 34 Figura 3. Spectru FT-IR pentru a.HCC, b. HAPg, c. HA

Figura 5 .Figura 6 .Figura 7 .

 567 Figura 5. Comportamentul hidrogelului HCC în a.70/30% (v/v) apă/DMF, b.amestec 50/50% (v/v) apă/DMF, c. amestesc 30/70% (v/v) apă/DMF.

Figura.

  Figura . Profilele ATG și derivatele lor pentru a. HAPg, b. PCL, c. CCH

Figura 9 .

 9 Figura 9. Spectrele FT-IR a. amidon, b.hidrogel pe bază de amidon nemodificat (HS)

Figura 15 .

 15 Figura 15. Cineticille gradului de umflare pentru hidrogelurile for HS, HSCP and HSPCL cu raport molar grupe -OH primare/CA 10:1, reticulate 4 și 5 ore (T=50°C).

Figura 16 .Figura 17 .

 1617 Figura 16. Cineticile de eliberare a levofloxacinei (mg) / g hidrogel uscat) pentru HS (a), HSCP (b), HSPCL (c) obținute în urma varierii CA, la pH = 7,4, 37° C; Concentrația de medicament încarcată a fost de 20 mg / mL.

5 .

 5 Studiul matematic al procesului de eliberare al medicamentului

  constanta relativă a acestui model [g/(mg*min)]

  față valoarea exponentului de eliberare "n" a fost considerată n=0.45 (o difuzie clasică Fickiană-eliberare controlată a medicamentului) și n=0.89 (indică un tip de transport II de eliberare relaxată, non-Fickiană, eliberare de ordin zero). Valorile cuprinse între 0.45 și 0.89 pot fi văzute ca fiind un indicator pentru amandouă fenomene (difuzia de medicament în matricea hidratată și relaxarea polimerului) în mod uzual numit transport anormal.

  Unitate zaharidicăstructurală. este cel mai abundent polimer natural, fiind găsită în pereţii plantelor, incluzând şi algele marine în această categorie.Cerinţele pentru modificările chimice vizează în principal îmbunătăţirea proprietăţilor mecanice, biocompatibilitate, solubilitate, controlul biodegradabilităţii şi al formei49 .Surfactanţii polimerici derivaţi din polizaharide au primit o atenţie deosebită 50 51 52 53 .Ataşarea lanţurilor hidrocarbonate pe scheletul diverselor polizaharide a fost foarte bine documentată de lucrările lui Landoll 54 . Iniţial, polimerii surfactanţi au fost studiaţi doar ca modificatori reologici. Abilitatea lor de a creşte în mod semnificativ vâscozitatea fazelor apoase, precum şi proprietăţile vâscoelastice ce le aduceau formulărilor apoase, s-au dovedit valoroase în mai multe aplicaţii. Recent, proprietăţile lor interfaciale au fost luate în considerare cu mai mult interes, în special pentru prepararea suspensiilor coloidale ce conţin particule cu caracteristici de suprafaţă bine definite.Numeroase aspecte ale absorbţiei lor la interfaţa lichid-lichid sunt puncte cheie în situaţii

practice. Prezenţa grupărilor multiple hidrofobice de-a lungul lanţului polimeric duce la o adsorbţie cvasi-ireversibilă. O consecinţă directă este stabilitatea emulsiei în diluţie. Adiţional, prezenţa buclelor hidrofilice ce acoperă suprafeţele picăturilor uleioase generează repulsii sterice. Aceste repulsii previn fuzionarea picăturilor, precum şi adsorbtia altor macromolecule (cum ar fi proteinele, de exemplu). În cazul polielectroliţilor, repulsiile electrostatice contribuie, de asemenea, la stabilitatea picăturilor.

  sau 48 de ore la temperatura camerei133 . Proba se pregătește la o concentrație diluată ( aprox. 1%) pentru a asigura că hidrogelul este dispersat în întregime în apă. Fracția gel este măsurată după cum urmează:Pentru determinări ale gradului de umflare se folosește metoda japoneză standard K8150, conform căreia, hidrogelul uscat este imersat în apă distilată pentru 48 de ore la temperatura camerei. După umflare, hidrogelul este filtrat pe o plasă din oțel inoxidabil cu 30 de grile. Gradul

	Măsurători ale gradului de umflare
	de umflare este calculat
			ecuația (3)
	unde W s reprezintă greutatea hidrogelului în fază umflată și W d este greutatea hidrogelului în
	stare uscată.
	O altă metodă de a caracteriza umflarea constă în imersarea gelului uscat în apă distilată pentru
	16 ore la temperatura camerei. După umflare, hidrogelul a fost filtrat și s-a calculat gradul de
	umflare conform
	Umflare = *100		ecuația (4)
	Fracția gel (hidrogel %)=	*100	ecuația (1)
	unde, W i este greutatea inițială a probei uscate și W d reprezintă greutatea părții uscate insolubile
	a probei după extracția cu apă.
	Metoda B.
	O metodă mai precisă de măsurare a fracției insolubile, a hidrogelului de fapt, constă în
	măsurarea greutății după filtrarea sub vid 134 . Greutatea W 1 a unei bucăți de hidrogel este
	determinată în urma uscării într-un cuptor la 105 °C pentru o oră și imediat răcită într-un exicator
	ce conține gel de siliciu. În funcție de materialul testat, o dispersie (S) de 1-2% poate fi pregătită
	în apă distilată urmată de hidratare peste noapte la temperatura camerei. Dispersia hidratată este
	ulterior centrifugată pentru 2-5 minute la 2500 rpm înainte de a fi filtrată.Uscarea hidrogelului se
	face într-un cuptor la 105 °C, urmată de o răcire până la o greutate constantă (W 2 ). Procentul
	fracției insolubile poate fi calculat astfel:
	% Hidrogel =	*100	ecuația (2)

PARTEA EXPERIMENTALĂ Capitolul II. MATERIALE ȘI METODE EXPERIMENTALE II.1. Materiale utilizate Denumire Formulă Alte specificații Furnizor

	În cadrul acestei teze, din lista lungă de polizaharide existente s-a ales spre modificare
	amidonul. Acesta va consitui componenta hidrofilă și poli(ε-caprolactona), componenta
	hidrofobă, în urma grefării lanţurilor de poli (ε-caprolactona) pe polizaharidă, conferindu-se
	caracterul amfifil produsului final.
	Amidonul este principala sursă de carbohidrați din dieta umană si din punct de vedere
	chimic este alcătuit din două polizaharide principale, amiloza și amilopectina, ultima
	componentă constituie aproximativ 80% din amidonul cel mai des răspândit. Procentajul celor
	Amidon solubil două polizaharide variază în funcție de originile botanice ale amidonului. Amiloza și ACS reagent
	30% amiloză și amilopectina au structuri diferite și proprietăți care au fost intens studiate si discutate de
	numeroși autori.		70% amilopectină
	L-ascorbat de sodiu
				Sigma-
	Sulfat de cupru	CuSO 4 *5H 2 O	ACS reagent	Aldrich
	pentahidratat (II),
	Bromura de propargil		80% wt soluție în
			toluen
	Azida de sodiu	NaN 3
	Dimetillformamida		(anhidră, 99,8%),
	Piridina		purit, ≥ 98.0%
	Trietilaluminiu		în soluție de toluen
			(1.9 M)
	Bromo-11 undecanol
	ε-caprolactona		Anhidru 99%,	Fluka
	Clorura de palmitoil		purit, ≥ 97.0%
	Acidul citric		Anhidru 99%	Acros
				Organics

  Tabelul 1. Caracteristici fizico-chimice importante ale amilozei şi amilopectinei 147 .

	Proprietate	Amiloza	Amilopectina
	Structură moleculară	Liniară (α-1, 4)	Ramificată (α-1, 4; α-1, 6)
	Masă moleculară	~10 6 Daltoni	~10 8 Daltoni
	Grad de polimerizare	1500-6000	3x10 5 -3x10 6
	Complex elicoidal	Puternic	Slab
	Culoare -iod	Albastră	Roşie-mov
	Soluţii diluate	Instabilă	Stabilă
	Retrogradare	Rapidă	Lentă
	Proprietate gel	Dens, ireversibil	Moale, reversibil
	Proprietate film	Puternic	Slab şi casant

Capacitatea de legare a iodului (CLI) de amiloză a fost determinată printr-o metodă spectroscopică care constă în urmărirea evoluției absorbanței unei soluții de amiloză (10ml) după adăugarea succesivă (20 μl) a unei soluții de iod. Măsuratoarea este realizată cu ajutorul unui spectrofotometru la lungimea de undă de 288 nm, lungime ce corespunde unui maxim de absorbție a iodului liber în soluție. Comparația cu o dreaptă etalon obținută pentru o soluție fără amiloză dă cantitatea de iod fixată, după cum este reprezentat în figura de mai jos (figura 2).

  Tabel 3. Analiza elementală a amidonului înainte și după esterificare.

	Nume probă C	O	N
	Amidon	60.2 39.5	0.3
	SCP1	79.8 21.2	-
	SCP2	80.2 19.8	-
	SCP3	88.2 11.8	-
	SCP4	72.3 27.7	-
	Analiza XPS a probelor a dezvăluit o bună corelare a rezultatelor analizei de suprafață cu
	determinările gradului de substituție.
	Nume	γ (mN•m -1 ) în	γ (mN•m -1 )
	probă	funcție de conc.	DMSO
	soluției (10mg/ml)
	SCP1	38.6
	SCP2	37.1		43
	SCP3	37.8
	Amidon	44
	Cu cât este mai mică valoarea pentru probele analizate comparativ cu valoarea DMSO-ului cu
	atât produșii sunt mai hidrofobi, analiză corelată și cu gradul de substituție obținut din analiza
	XPS.

III.1.2.2. Analiza tensiunii superficiale

S-au realizat măsurători al unghiului de contact la interfața lichid-aer prin metoda picăturii, folosind ca solvent DMSO. Tabel 4. Valorile unghiului de contact la interfața lichid-aer. III.1.2.3. Analiza morfologică Figura 3. Imagini SEM pentru a. amidon și b. amidon modificat (SCP3)

Sinteza poli(ε-caprolactonei) cu grupare azidică III.3.1. Principiul reacției

  Sinteza decurge în două etape: în prima se obține PCL-funcționalizat pe capăt cu Br, iar în cea de a doua se introduce funcția azidă, terminală.După filtrarea sărurilor reziduale și spălarea cu apă distilată produsul a fost extras cu diclormetan.Faza organică s-a uscat cu MgSO 4 anhidru, apoi a fost filtrată și evaporată sub vid. După evaporarea solvenților s-au obținut, în functie de gradul de polimerizare, produsi (7.89 g) sub formă vâscoasă (pentru un DP=4) şi pudre albe (pentru DP >4).

	III. 3.2.
	Obţinerea poli(ε-caprolactonei) funcţionalizată terminal cu Br
	Polimerizările au fost realizate folosind tehnicile standard Schlenk sub atmosferă inertă
	de argon. ε-caprolactona, soluția de bromo-11-undecanol în toluen au fost pastrate pe site
	moleculare (3Å) în tuburi Schlenk uscate în prealabil în etuvă 156 .
	Azidarea poli(ε-caprolactonei) bromurată terminal
	Br	OH
	O
	O
					O
	Al(OEt) 3	Br		O	OH n
				Deplasare chimică NaN 3
		Amidon	Amidon propargilat	O
	C2 C3	73.78 72.70	N 3	73.78 72.70	O	OH n
	C4	79.51		-
	C5 Schema 4. Mecanismul reacţiei de polimerizare a ε-caprolactonei şi a substituirii bromului 72.28 72.28
	a	-	80.9 (carbon cuaternar) * terminal cu NaN 3 .
	b	-		77.33 (carbon cuaternar) *
	c	-		58-59.79 (CH 2 nou apăruți)

* a se vedea explicațiile din capitolul IV.

1.1.1.2, caracterizare RMN.

III.3. Reacțiile au fost realizate într-un balon de 250 mL, prevazut cu 3 gaturi. Pentru un grad de polimerizare DP=4, într-o primă etapă s-a adăugat o cantitate de toluen în balon, apoi s-a transvazat, tot sub argon, o cantitate determinată de soluție de bromo-11-undecanol în toluen (38 mL,0.52 M, 0.020 mol) și o cantitate de AlEt 3 (1mL dintr-o solutie 1,1 mol/L). S-a încălzit baia de apă la 50°C și apoi s-a adăugat ε-caprolactona

(4.5 g, 38.6 mmol)

. După conversia completă a monomerului, care a durat aprox. 5 ore, polimerul a fost precipitat în heptan rece, menținut în prealabil la frigider peste noapte. Agitarea joacă un rol important în eliminarea toluenului din poli(ε-caprolactonă), de aceea se recomandă să fie cât mai puternică. Precipitatul s-a separat prin filtrare, apoi a fost uscat la temperatura camerei, sub nișă. PCL-Br (10 g, 39.8 mmol) și NaN 3 (7.76 g, 119 mmol) s-au solubilizat în 200 mL de DMF. S-a agitat amestecul de reacție în absența luminii, timp de 15 ore, la temperatură ambiantă.

Analiza rezultatelor obținute III.3.2.1. Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR)

  Eficienţa grefării este dificil de determinat în cadrul acestui sistem prin tehnici de analiză standard, cum ar fi RMN-ul, datorită solubilităţii scăzute a produşilor în solvenţii organici standard. Calculul descris mai sus nu s-a putut realiza decât pe o singură probă.

	Conform literaturii 203 semnalele amidonului sunt atribuite după cum urmează
					OH
		O	4 OH	3 6	5	2	O OH	1	O
	Carbonul glicozidic C1 (101.2 ppm), C4 (81.4 ppm), C2,3,5 (72.2 ppm) și C6 (61.9 ppm).
	Semnalul carbonului C4 s-a arătat că este caracteristic fazei amorfe deoarece nu a fost detectat în
	probele hidratate, cu o cristalinitate ridicată 204 .
	PCL nemodificat are următoarele atribuiri ale semnalelor, pentru carbonii metilenici numerotați
	de la I la V:
		-(O-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CO) n -
	13 C C 1	Deplasare chimică (ppm) 100.22 I III	1 H H 1.a V IV II Deplasare chimică (ppm) 5.09
	C2 C 3 Tabel 9. Valorile deplasărilor chimice pentru carbonii PCL. 73.37 H 1.b 72.19 H 2	5.02 3.67
	C 4 C 5	79.10 71.77 Grupare		H 3 H 4 Deplasare chimică	3.32 3.36
	C 6	60.85 Carbonil				H 5 173.5	3.60
		O CH 2 I			H 6.a 65.3, 64.0	3.67
	C α	33.55 CH 2 II			H 6.b 33.8,33.1	3.60
	C αt	33.76 CH 2 III			H α.a 28.9	2.24
	C β C βt C γ	24.11 CH 2 IV 24.45 24.99 CH 2 V			H α.b 25.7 H β 25.2	2.17 1.30
	C γt	25.13
	C δ	27.89					H γ		1.53
	C δt	32.13				H δ.a		1.54
	C ε	63.51				H δ.b		1.40
	C εt	60.85				H ε.a		3.97
	C=O	172.77				H ε.a		3.37
	De menționat că în ceea ce priveste notația protonilor din unitatea amidonului, a
	corespunde formei liniare, iar b celei ramificate.
					100

  Se observă ca în cazul acestor compuși avem pic-uri distinctive deoarece cristalizarea polimerului este distribuită uniform, fapt ce duce la topirea mai lentă a unor componente. De asemenea, existența ramificațiilor și sub-ramificațiilor contribuie la apariția diferitelor pante în punctul de topire, iar diferitele aranjamente și greutăți moleculare ale polimerului pot schimba modul cum aceste pante apar în profilul DSC. Pentru fiecare copolimer sunt observate două endoterme distincte în ceea ce privește fenomenul de topire, fapt ce indică o fază de separare clară între domeniile hidrofobic și hidrofilic, atât punctul de topire, T m , cât și căldura de topire (ΔH f ) sunt afectate de greutatea lor moleculară. Comparând ciclurile 1 și 2 care au același bloc de amidon, atât T m , cât și ΔH f ale blocului PCL cresc odată cu creșterea greutății moleculare.. Pic-ul T m din blocul amidonului din ciclul 2 este destul de larg cu ΔH f redusă, fapt ce indică dificultatea în cristalizarea segmentului de amidon, deoarece este înconjurat de segmentul de greutate moleculara mare al PCL.Rezultate similare au fost observate în alte sisteme copolimerice amififile.209 Prezența componentei amorfe AGU poate influența într-un mod puternic comportamentul ratei de cristalinizare al PCL prin faptul că acest component are un T g mai mare decât temperatura onset de cristalizare a PCL. Acest fapt ar duce la o descreștere a ratei de cristalinizare, în special atunci când conținutul compusului amorf crește.

				1 *	2 *	1	2	1	2
	Amidon	2.97	30.71	28.23 2.63	2.92	40.94 40.55 44.32 43.68
	SPCL2	13.13	30.71	28.05 14.38	12.54	51.81	40	55.51 43.87
	SPCL3	22.6	23.06	18.72 25.35	24.10	52.20 45.11 58.28 50.18
	*Notație ce corespunde primului, respectiv celui de-al doilea ciclu de încălzire/răcire.

  apare în curba DSC, după încălzirea amidonului. Considerând în timpul răcirii, etrapolarea celui de-al treilea segment al diagramei teoretice pentru un polimer semicristalin, se poate atribui această deplasare tranziției vitroase a amidonului. Pentru amidonul din grâu și amidonul din porumb cu conținut ridicat de amiloză, s-au localizat tranzițiile vitroase în intervalul 173 -183 °C. Nu s-au observat alte schimbări în comportamentul acestei polizaharide la temperaturi mai mari210 .Apa acționează ca un plastifiant în ceea ce privește lanțurile de amiloză și amilopectină ale amidonului, afectând în mod dramatic și temperatura de tranziție vitroasă. Astfel, cu cât este mai mare conținutul de apă, cu atât este mai mare si T g . Gelatinizarea cu apă a amidonului din grâu are loc în intervalul 65-125°C, procedeu prin care cristalinitatea polimerului este distrusă gradual. Un amidon negelatinizat ar fi produs un pic endotermic în acel interval, dar nu a fost nici unul, fapt ce a indicat ca gelatinizarea completă a avut deja loc. Cantitatea de dublu helix în amidonul nemodificat ar trebui să fie strâns corelată cu conținutul în amilopectină, cristalinitatea crescând odată cu aceasta 211 , amidonul cu conținut variat de amiloză indică că temperaturile de gelatinizare cresc cu creșterea cantităților de amiloză. Un studiu pe 11 tipuri de amidon cu proprietăți variabile de gelatinizare a arătat că polizaharida cu temperaturi scăzute de gelatinizare are material amorf mai mult și mai puțin cristalin comparativ cu polimerii cu temeraturi ridicate de gelatinizare. O explicație a acestui fenomen este că perfecțiunea cristalelor ar putea fi principalul mecanism ce controlează temperatura de gelatinizare. Alți factori, cum ar fi cantitatea de amidon deteriorat, tehnici de izolare și varierea condițiilor climatice în timpul cultivării, influențează de asemenea această temperatură. În ceea ce privește amidonul, un biopolimer parțial cristalin, fenomenul de topire nu poate începe înainte de a depăși regiunea caracteristică tranziției vitroase.

	O deplasare distinctă
	Amidon
	SPCL2
	Temperatura (°C)

  Tabel 12. Normalizarea intensității pentru pic-ul caracteristic PCL, 131, în modul negativ (C 6 H 11 O 3 -) și pentru pic-ul caracteristic PCL, 115, în modul pozitiv ([M+H] + ).Tensiunea superficială a fost obținută prin metoda picăturii, la interfața lichid-aer, în același mod descris anterior la capitolul III.1.2.2.Tabel 13. Valorile unghiului de contact la interfața lichid-aer.

		Probă		Pic 131	Pic 115 Cuantificare
		SPCL2		3.3 ± 0.1 5.4 ± 1.5 0.6 ± 0.0
		SPCL3		3.1 ± 0.7 4.0 ± 1.7 0.8 ± 0.0
	Cuantificarea atât pentru C 6 H 11 O 3	-cât și pentru [M+H] + arată că diferențele dintre SPCL2 și
	SPCL3 sunt foarte mici și ca suprafața este dominată de semnatura amidonului, a se vedea
	raportul 58 (C 2 H 2 O 2	-)/59 (C 2 H 3 O 3	-).
	IV.2.1.4. Analiza tensiunii superficiale
		Nume		γ (mN•m -1 ) în	γ (mN•m -1 )
		probă		funcție de conc.	DMSO
				soluției (1mg/ml)
		SPCL2		42.05
		SPCL3		38.2	43
		Amidon		44

V.1. Obținerea hidrogelurilor pe bază de amidon prin reticulare cu epiclorhidrină V.1.2. Principiul reacției

		O
		H	HO	O
	H	OH HO OH O H	H H	H O O H H	O	OH O	H	H	H	O H H	O OH O	H	O O H HO OH HO H H OH H CH 2 O H O H O H	O	O OH	H	H	H	H O H	OH O O
					+						-HCl				O
																	CH 2
				CH 2	HC		CH 2		Cl				HC
					O										H 2 C O	OH
															CH 2
														O
													H				O
																	H
													H		OH
													H HO OH O	H H	O H O H	O	OH O	H	H	H	O H H	O O OH
					Schema 1. Mecanismul reacţiei de reticulare cu epiclorhidrină.

2. Modificarea chimică a hidrogelurilor pe baza de amidon funcționalizat cu grupare de tip alchină, prin reacția cu PCLN 3 via click chemistry V.2.1. Principiul reacției

  Urmărind reacţia tipică de grefare prin click chemistry a PCL-N 3 pe lanţul de amidon descrisă mai sus avem următorul protocol experimental: hidrogelul pe bază de amidon propargilat (0.6 mmol), reticulat cu epiclorhidrină se lasă sub agitare peste noapte să se umfle în apă, apoi se adaugă azido-PCL (0.6 mmol) dizolvată în DMF; amestecul de apă şi DMF (10 ml) se menţine la raportul de 1:1. Sunt apoi adăugate soluții proaspăt preparate de ascorbat de sodiu

	(0.12 mmol, 120 μL, 1M) în apă și o soluție 75% de sulfat de cupru II hidratat cu 5 molecule de
	apă (8 μL, 0.024 mmol ). Amestecul a fost agitat în absența luminii, timp de 24 de ore, sub
	atmosfera inertă, la 60º C. Produsul final a fost precipitat în apă şi dializat într-o soluţie apoasă
	de 0.1 M EDTA timp de 5 zile folosind o membrană celulozică (Orange Scientific, MWCO:
	3500 Da) pentru a îndepărta catalizatorul. Apa a fost înlocuită de două ori pe zi. Produsul final a
	fost liofilizat.
			O
	O	O	O
		CH 2
		O					O
		CH 2 HC OH	+	N 3	O	OH n
		CH 2
		O			Na Asc
		CH 2		CuSO 4 * 5H 2 O	O
	O	OH	O O	O		N	N	O	OH
						N
						O
					O	O	O
					CH 2
					O
					CH 2 HC OH	+
					CH 2
					O
					CH 2
					O	O	O
					OH	O
						N	N	O
						N		O	OH n

n Schema 2. Mecanismul reacţiei "click chemistry" dintre PCL-N 3 şi hidrogelul pe bază de amidon funcţionalizat cu triple legături, reticulat cu epiclorhidrină.

V.2.

2. Analiza rezultatelor obținute V.2.2.1. Caracterizarea prin spectroscopie FTIR

Probele au fost pregătite după următoarea procedura generală: la o soluţie polimerică de 12% amidon (0.3 g) a fost adăugată o cantitate determinată de acid citric (Tabel 1) şi s-a lăsat sub agitare 20 min. În cazul probelor pe bază de amidon nemodificat a fost necesară ultrasonarea pentru îndepărtarea bulelor de aer. Soluțiile au fost plasate într-o etuvă sub vid la 50°C pentru anumite intervale de timp, în funcţie de compoziţia lor.

Terminologia folosită pentru acest capitol este următoarea: HS-hidrogel pe bază de amidon nativ, HSCP-hidrogel pe bază de amidon modificat prin grefare cu lanţuri de clorură de palmitoil, HSPCL-hidrogel pe bază de amidon modificat cu lanţuri de policaprolactonă. S-a observat că valorile coeficienților de corelare pentru primul model de ecuație variază între 0,927 și 0,998 iar majoritatea valorilor q e variază semnificativ față de valorile experimentale. Corelările (R 2 ) au fost folosite ca indicatori pentru o mai bună fitare a fiecărei ecuații considerate, eliberarea levofloxacinei urmând îndeaproape modelele de ordinul unu și doi. În orice caz, conform valorilor neglijabile ale R 2 pentru datele de eliberare, se constată că aplicarea acestor modele matematice este pur empirică.

V.3.2. Program experimental

Fitarea datelor experimentale cu cele trei modele de hidrogeluri este redată în figura 18.