text: Für die finanzielle Unterstützung durch das Auslandsstipendium möchte ich dem Karlsruhe House of Young Scientists (KHYS) danken, welches die Zusammenarbeit mit den Kollegen der Harvard Medical School ermöglicht hat. Die kurze aber intensive Kollaboration war außerordentlich gewinnbringend. Von den Kollaborationspartnern gilt mein Dank besonders PhD Randall Peterson, in dessen Lab die Forschung statt fand, PhD Anjali Nath und PhD Xiang Li, die mich sofort kollegial in das Umfeld eingeführt haben und vor allem PhD David Kokel, der mich nicht nur in die Arbeiten integriert hat, sondern mir gleich vom ersten Tag an ein zu Hause in der Fremde geben hat.
  Schlussendlich gilt ein großer Dank meiner Familie: Meiner Frau Christine für das fleißige Korrekturlesen, meinen Eltern sowie meiner Schwester Marion für ihre Unterstützung in Worten und Taten.
  Einleitung 1.Bedeutung der Arbeit
  Bildbasierte Hochdurchsatz-Systeme ermöglichen das systematische massenweise Testen und Einordnen der Aktivität chemischer Substanzen in diversen Bereichen der Biologie, Toxikologie, Pharmakologie und Genetik. Machbarkeitsstudien zellbasierter Screens mit niedrigen Stückzahlen entwickelten sich in den letzten Jahren schnell zu robusten und umfassenden Industriestandards mit teilweise immensen Stückzahlen von Einzelversuchen sowie einer Größenordnung bis in die Hunderttausende. Allerdings sind Schlussfolgerungen (z.B. Auswirkungen auf den Menschen und die Umwelt) aus den bisher fast ausschließlich zellbasierten Untersuchungen schwierig, Erkenntnisse müssen meist durch langwierige Tierversuche überprüft und schließlich durch diese oft widerlegt werden . Wird das Potenzial des Hochdurchsatzes durch die Ausweitung der Analyse auf einen vollständigen Modellorganismus, wie z.B. die Eier des Zebrabärblings, ausgeweitet, so sind folgende ökonomische sowie ethische Ziele erreichbar :
  • eine höhere Effektivität durch geringere Fehlprognosen,
  • die Reduktion von Tierversuchen zur Bestätigung von Ergebnissen,
  • die Erhöhung des Durchsatzes bereits bestehender manueller Untersuchungen an Gesamtorganismen wie dem Zebrabärbling sowie
  • die Einsparung von Kosten, Personal und Zeit für die Versuchsdurchführung.
  Eine geeignete Hochdurchsatz-Untersuchung erfordert eine auf die speziellen Anforderungen abgestimmte Versuchsauslegung, die schnelle und zuverlässige Erfassung und Analyse der Bildinhalte sowie eine klare zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse. Herausfordernd ist, dass sich der auszuwertende Effekt von Versuch zu Versuch stark unterscheidet und durch die hohe Versuchsanzahl die Qualität der aufgezeichneten Daten stark schwankt. Daher beschränken sich bisherige Lösungen auf die (Teil)Automatisierung von einfachen, informationsarmen oder die manuelle Auswertung von komplizierteren, informationsreichen Untersuchungen. In der vorliegenden Arbeit werden ein neues Konzept sowie neue Verfahren zur Gewinnung von Informationen aus Hochdurchsatz-Untersuchungen an Modellorganismen entwickelt und am Beispiel des Zebrabärblings erprobt, was für eine schnelle automatisierte Erforschung biologischer Zusammenhänge und der Analyse von Einflüssen innerhalb von Organismen sowie zur Entdeckung neuer Wirkstoffe eine Schlüsseltechnologie darstellt.
  1.2 Darstellung des Entwicklungsstandes Als Hochdurchsatz-Untersuchungen werden Batch-Tests oder Siebtests bezeichnet, welchen in der Biologie gewöhnlich genetische, pharmakologische oder toxikologische Fragestellungen zu Grunde liegen und die eine große Anzahl an Einzeluntersuchungen beinhalten. Hochdurchsatz-Untersuchungen sind besonders in der Pharmakologie weit verbreitet und ermöglichen das schnelle Durchführen von Millionen von Tests. Mittels solcher Tests lassen sich beispielsweise rasch Antikörper, (bio)aktive Substanzen oder Gene, die bestimmte biologische Wirkungspfade beeinflussen, identifizieren. Sie ermöglichen, in kurzer Zeit eine große Anzahl von Proben in weiten Teilen automatisiert zu testen. In der Toxikologie wird aus den Ergebnissen der Tests zum einen das Gefahrenpotenzial von Substanzen bestimmt, zum anderen das Verständnis biochemischer Prozesse verbessert. In der Pharmakologie dient die Identifikation bioaktiver Substanzen zudem als Ausgangspunkt zur Erforschung neuer Wirkstoffe, die potenziell als Basis neuartiger Medikamente in Frage kommen, oder wird zur Erforschung biochemischer Prozesse im Organismus herangezogen .
  Die Abb. 1.1 zeigt den derzeit üblichen Ablauf der Versuchsauslegung für Hochdurchsatz-Untersuchungen. Auf die Parameter der Blöcke " Biologie", " Bildakquise" und " Analyse & Interpretation" wird hierbei Einfluss genommen. Es wird die Art der Bildakquise, die Auswertemethode, Versuchsparameter sowie die Anzahl der durchzuführenden Einzeluntersuchungen manuell festgelegt. Die Auslegung der Untersuchungen wird in der Forschung gemäß der Erfahrung des Experimentators durchgeführt und basiert nicht auf systematischen Entscheidungskriterien.
  Unabhängig von Fragestellung, Ziel und Umfang der Hochdurchsatz-Untersuchung wird ein biologisches Signal benötigt, welches sich bei der Datenerfassung beobachten und quantifizieren lässt. Unter dem Begriff Biosignal wird meist eine elektrische Spannung als Ergebnis biologischer Aktivitäten verstanden und als Nutzsignal in den folgenden Schritten weiter verarbeitet. Nutzsignale sind oft mittels Elektroden gewonnene ( Änderungen von) Spannungen wie etwa die Elektrokardiografie (EKG), die Elektroenzephalografie (EEG), die Elektromyografie (EMG) oder das Elektroretinogramm (ERG). Generalisiert betrachtet umfasst der Begriff jedoch auch alle beobachtbaren und quantifizierbaren nicht-Mikrotiterplatten werden nicht nur bei der Versuchsdurchführung angewandt, sondern auch zur Lagerung und Sortierung von chemischen Komponenten verwendet. In einem solchen Fall lagert in jedem Näpfchen eine Substanz, von der eine detaillierte Dokumentation existiert. Derart befüllte Platten sind als Bibliotheken auch kommerziell erhältlich und werden als " Stock-plates" (engl.) bezeichnet (vgl. Abb. 1.2). Die Stock-Plates werden oft gefroren gelagert und nicht direkt in der Hochdurchsatz-Untersuchung verwendet, sondern eine definierte Menge der zu untersuchenden Substanzen wird entnommen und der Hochdurchsatz-Untersuchung zugeführt. Meist sind Wirkstoff-Familien auf einer solchen Stock-Plate zusammengefasst, und daher wird die gesamte Stock-Plate auf diese Weise dupliziert und untersucht. In einem typischen Versuch wird in das Gemisch aus Chemikalie und Trägerflüssigkeit eine biologische Einheit gegeben. Bei einer biologischen Abbildung 1.2: Mikrotiterplatten organisieren im Hochdurchsatz sowohl die Einzeluntersuchungen, als auch die chemischen Bibliotheken. Im obigen Beispiel aus werden auf die in einer Well-Plate vorbereiteten Larven (links) Substanzen aus einer Bibliothek (Mitte) geben. Im rechten Bild ist das exemplarische Ergebnis dargestellt. Hier wurden zwei Wells markiert, welche sich von den anderen unterscheiden, z.B. durch einen abweichenden Entwicklungsprozess der Larven.
  Einheit handelt es sich z.B. um eine Zelle, Zellkultur oder einen biologischen Modellorganismus wie etwa einen tierischen Embryo. Nach einer Inkubationszeit, in welcher der Wirkstoff mit der biologischen Einheit interagieren kann, werden Messungen mittels diverser Detektoren (vgl. Abschnitt 2.4) automatisiert oder manuell von den Einheiten durchgeführt . In bildbasierenden Hochdurchsatz-Untersuchungen erfolgt die Generierung der Messwerte meist durch visuelle Auswertung der Versuche . Die Messwerte werden auf Auffälligkeiten, sog. hits (engl. für Treffer), untersucht. Die Möglichkeit, einzelne Zellen z.B. durch fluoreszierende Proteine zu markieren, hat die Robustheit und den Durchsatz der Versuche, zumindest bei zellbasierten Versuchen, in den vergangenen Jahren stark gesteigert . Diese einfach gehaltenen Untersuchungen, bei denen lediglich die Anwesenheit oder Menge des fluoreszierenden Proteins ausgewertet wird, sind selbst ohne fortgeschrittene Bildverarbeitung und Segmentierungstechnik möglich. Kombiniert mit Automatisierungstechnik lassen sich bei derartigen Untersuchungen sehr hohe Zahlen an Einzelversuchen pro Tag erreichen. Der Begriff Hochdurchsatz ist indes nicht genau definiert, wird aber weithin bei einem Durchsatz zwischen 10 000 und 100 000 Proben pro Tag verwendet .
  Manuell durchgeführte Experimente sind meist der Ausgangspunkt, aus dem ein Hochdurchsatz-Experiment abgeleitet wird. Die Versuchsprotokolle der manuellen Untersuchungen im Labor müssen angepasst werden, damit sie sich für den Hochdurchsatz eignen . Wichtige Bedingungen sind:
  • Gute Reproduzierbarkeit und Stabilität des Nutzsignals zwischen einzelnen Näpfchen und Platten. Dies gilt sowohl bezüglich des Reaktanten, der biologischen Einheit sowie der verwendeten Geräte (z.B. bei Verwendung mehrerer Mikroskope etc.)
  • Hohe Zuverlässigkeit der verwendeten Positiv-und Negativkontrollen
  • Ausreichende Sensibilität des Nutzsignals zur Identifikation von Substanzen mit schwachem Effekt auf die biologische Einheit
  • Wirtschaftlichkeit der Hochdurchsatz-Untersuchung (standardmäßig gemessen in Kosten pro Näpfchen).
  Aus den Abweichungen und Schwankungen zwischen den Platten und Kontrollen lassen sich Kontrollparameter berechnen, welche Auskunft über die Robustheit des Versuchs geben. Zur Validierung, inwieweit sich ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Untersuchung eignet, haben sich verschiedene Parameter etabliert (vgl. Tabelle 1.1).
  Das Signalfenster und der Z -Faktor dienen zur Abschätzung zwischen dem Minimum und Maximum der Messungen und der Präzision der Werte innerhalb einer Platte und plattenübergreifend. Das Signalfenster bestimmt einen Parameter, welcher die Signifikanz zwischen dem maximalen und minimalen Messwert einer Versuchsreihe quantifiziert. Dieser ist jedoch nicht in gleichem Maße verlässlich wie der Z -Faktor . Der Z -Faktor ermöglicht durch die einheitenlose Skala (von 0 bis 1) den Vergleich verschiedener Versuche und Versuchsdurchläufe miteinander. Hierbei werden auch Kontroll-Näpfchen (Z ) und Versuch-Näpfchen (Z ) miteinander verglichen. Niedrige Werte innerhalb der Kontrollen deuten beispielsweise auf eine Kontaminierung der Näpfchen oder ein anderes Problem in der Versuchsdurchführung hin. Die Sensitivität der Untersuchung ist ein Messwert zur Bestimmung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, welche sich mittels des Minimum-Signifikanz-Verhältnisses (MSR) quantifizieren lässt .
  Zebrabärbling als Modellorganismus für den Hochdurchsatz
  Als biologische Einheiten kommen im Hochdurchsatz meist Modellorganismen zum Einsatz. Modellorganismen sind z.B. ausgewählte Pflanzen, Tiere, Bakterien oder Pilze, die mit einfachen Methoden gezüchtet bzw. untersucht werden können und von besonderer Bedeutung für die biologische/biomedizinische Forschung sind. Sie zeichnen sich in der Regel durch eine kostengünstige sowie unkomplizierte Haltung bzw. Nachzucht aus und sind in vielfältiger Hinsicht sehr gut dokumentiert. Darüber hinaus gehören einige dieser Arten zu den ersten Spezies, deren komplettes Genom entschlüsselt werden konnte. Die Wahl des Modellorganismus hängt in der Regel von der biologischen Fragestellung ab. An Einzellern lassen sich beispielsweise gut zellbiologische Prozesse untersuchen. Mehrzellige Lebewesen hingegen werden vor allem für entwicklungsbiologische oder toxikologische Untersuchungen benötigt. Umfassend behandelt werden Modellorganismen in . Bei der Forschung an Modellorganismen wird versucht, allgemein gültige und auf andere Organismen, insbesondere dem des Menschen, übertragbare Erkenntnisse zu erhalten. Ein Grundproblem der etablierten Modellorganismen in der Toxikologie und Entwicklungsbiologie, wie z.B. der Fruchtfliege (Drosophila melanogster ), dem Fadenwurm (Caenorhabditis elegans) oder dem Krallenfrosch (Xenopus laevis), ist die relativ große entwicklungsgeschichtliche Distanz zum Menschen . Säugetiere, wie z.B. die Maus oder die Ratte, besitzen jedoch im Vergleich zu Insekten und Amphibien eine niedrigere Anzahl an Nachkommen und eine ungleich längere Generationszeit. Zudem entwickeln sich die Nachkommen innerhalb des Mutterleibes, wodurch toxikologische Untersuchungen bzw. Manipulationen am Embryo technisch aufwändig sind und sich nur schwer observieren lassen. Säugetierorganismen sind dem menschlichen Organismus am ähnlichsten, so dass an ihnen erzielte Forschungsergebnisse oft aussagekräftige Informationen über Verhältnisse beim Menschen liefern. Jedoch ist eine Hochdurchsatz-Untersuchung aufgrund der oben geschilderten Nachteile und aufgrund der für die Analyse benötigten hohen Anzahl an Messdaten und damit an Individuen in der Praxis häufig nicht wirtschaftlich, technisch schwierig durchführbar und ethisch bedenklich.
  Der Zebrabärbling ist ein auf dem indischen Subkontinent beheimateter, ausgewachsen ca. 3 bis 5 cm großer Karpfenfisch (Cyprinidae) und hat in den wissenschaftlichen Laboratorien der Entwicklungsbiologen eine erstaunliche Karriere gemacht . Auch in der Industrie gewinnt der Zebrabärbling an Bedeutung. Eine ständig wachsende Zahl von Laboren versucht, anhand des Fisches biologische Vorgänge zu verstehen, die Ursachen menschlicher Erkrankungen aufzuklären und neue Medikamente zu entwickeln.
  Der Zebrabärbling verbindet die Vorteile einer kurzen Generationszeit mit einer hohen Anzahl von Nachkommen und technisch leicht zugänglichen Larven, die sich außerhalb des Mutterleibes entwickeln. Als Vertreter der Wirbeltiere (Vertebraten) besitzt er alle Organsysteme, die auch im Menschen vorkommen wie z.B. Auge, Hirn, Herz, Drüsen etc. Sein Immunsystem lässt sich im Gegensatz zu dem von Insekten gut mit dem des Menschen vergleichen. Des Weiteren wird davon ausgegangen, dass die überwiegende Zahl aller menschlichen Gene im Fisch nicht nur vorkommt, sondern auch sehr ähnliche oder sogar die gleichen Funktionen besitzen. Zudem sind die Zellen sowie die äußere Fruchthülle um die Larven (das sog. Chorion) transparent, wodurch eine einfache Beobachtung mit dem Lichtmikroskop möglich ist. Die hohe Transparenz der Zellen ermöglicht eine genaue Beobachtung der sich bildenden Organe oder der Herzfrequenz und der Blutströmung am lebenden Embryo. Während von den Zebrabärblingslarven scharfe Detailaufnahmen die Identifizierung einzelner Zellen ermöglichen, stehen von anderen, lebenden, vertebralen Embryonen oder auch von lebenden menschlichen Embryonen nur weitaus schlechtere Bilder, wie z.B. unscharfe und kontrastarme Ultraschallaufnahmen, zur Verfügung. Laut der EU Direktive 2010/63/EU fallen Versuche an frühen Tierembryonen nicht unter das Tierschutzgesetz und müssen somit nicht als Tierversuche angemeldet werden, was den administrativen Aufwand für Versuche mit hohen Stückzahlen verringert. Der Zeitpunkt, ab dem die Embryonen unter das Tierschutzgesetz fallen, ist der Zeitpunkt, ab dem diese eigenständig auf Futtersuche gehen. In wird der Zeitpunkt von 120 Stunden nach der Befruchtung [hpf] empfohlen. Weiterführende Literatur zum Zebrabärbling als Mo-dellorganismus in der Forschung findet sich z.B. in .
  Die Zebrabärblingslarve hat für Hochdurchsatz-Untersuchungen großes Potenzial. Bereits 1996 wird von auf zahlreiche Literatur zum Potenzial des Zebrabärblings hingewiesen, die Vorteile des Fisches in vielen Forschungsgebieten ausführlich diskutiert und dieser als der Nachfolger der Fruchtfliege bezeichnet. An der Fruchtfliege als Modellorganismus gelangen bahnbrechende Erfolge bei der Identifizierung essentieller Gene in der Embryonalentwicklung. Diese Arbeit von Christiane Nüsslein-Volhard wurde 1995 mit dem Nobelpreis für Medizin und Physiologie ausgezeichnet . Verglichen mit anderen Wirbeltieren verläuft die Entwicklung der Larve des Zebrabärblings sehr schnell und fast jeder Entwicklungszeitpunkt lässt sich verfolgen und in Bildern aufzeichnen. Die Eizelle, die sich oberhalb der Dotterkugel befindet, beginnt sich bereits Minuten nach dem Ablaichen und der Befruchtung zu teilen (Abb. 1.3a). Der beschriebene Vorgang wurde bereits mittels Bildverarbeitung geprüft und verfolgt von . Diese Art von Auswertungen sind jedoch bisher aufgrund der großen Datenmengen nicht für den Hochdurchsatz geeignet.
  Aus den ersten Zellen bildet sich innerhalb von vier Stunden durch Zellteilungen eine Gruppe aus einigen tausend Zellen (Abb. 1.3b), welche in den folgenden sechs Stunden den Dotter umwachsen. Zehn Stunden nach der Befruchtung zeichnet sich allmählich der Kopf der Larve ab (Abb. 1.3c-e) und nach 18 Stunden sind am Kopf die ovalen Vorläufer der Augen sowie im Rumpf die ersten Muskeln erkennbar. Kurze Zeit später beginnt der Schwanz sich zu strecken, die meisten Organe sind angelegt, das Herz fängt an zu schlagen und die nur knapp 24 Stunden alte Larve bewegt sich bereits im Chorion. Während des dritten Tages nach der Befruchtung ist die Larve fertig entwickelt. Sie schlüpft und schwimmt die ersten kurzen Strecken (Abb. 1.3f-i). Nach fünf Tagen schließlich hat sie ihren Dottervorrat aufgebraucht und sucht selbstständig nach Futter. Trotz der rasanten Entwicklung dauert es dann immerhin noch drei Monate, bis ein Zebrabärbling geschlechtsreif wird. Eine genaue Beschreibung des Entwicklungsprozesses findet sich in . Die beschriebenen Merkmale des Zebrabärblings lassen sich lichtmikroskopisch leicht observieren. Alle Aufnahmen in Abb. 1.3 wurden mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop aufgezeichnet. Es existieren bereits automatisierte Systeme zum Erkennen diverser Phä- Abbildung 1.3: Ausgewählte Entwicklungsstadien der Zebrabärblingslarven. Unter den Bildern ist jeweils das ungefähre Alter in Stunden nach der Befruchtung angegeben. notypen oder Endpunkte .
  Zum Verständnis eines weiteren Vorteils des Zebrabärblings, dem Einsatz sog. Transgene, wird im Folgenden kurz auf das Grün Fluoreszierende Protein eingegangen. 1961 beschrieb und extrahierte erstmals Osamu Shimomura das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) einer Tiefseequalle , welches bei Anregung mit blauem oder ultraviolettem Licht grün fluoresziert. Von unschätzbarem Wert ist das GFP, da es sich als Marker für die Genexpression nutzen lässt. Eine mit Hilfe des Proteins markierte Zelle erfüllt die gleiche Funktion wie eine nicht markierte Zelle, mit dem Unterschied, dass die markierten Zellen nach Anregung mit einer passenden Wellenlänge fluoreszieren d.h., leuchten. Ein Organismus, in den ein solcher Marker eingebracht wurde, wird als Transgen bezeichnet. Auch im Zebrabärbling lassen sich auf die beschriebene Art Transgene generieren. Unmittelbar mit der Entstehung einer derart markierten Zelle im Zebrabärbling lassen sich räumliche und zeitliche Verteilung und Bewegungen der Zelle studieren. Für die Entdeckung und Extraktion des GFP wurde im Jahr 2008 der Nobelpreis für Chemie an Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien verliehen. Es existieren neben dem GFP bereits Varianten in anderen Farben (z.B. CFP (cyan) oder YFP (yellow)), so dass sich auch mehrere Zelltypen des Zebrabärblings gleichzeitig und unabhängig beobachten lassen . Die Möglichkeit, die genannte Technik des Markierens von Zellen im Zebrabärbling anzuwenden , eröffnet für den Modellorganismus alle Möglichkeiten, die die moderne Fluoreszenzmikroskopie bietet . Hervorzuheben sind hier Aufnahmetechniken, die es ermöglichen, Zellbewegungen über die Zeit und/oder in 3D zu akquirieren. Die erzielbare Auflösung reicht von makroskopischen Bildern einfachster Aufbauten über die bereits als Standard geltende Konfokal-Mikroskopie , die spezialisierte Hochdurchsatz-Mikroskopie bis hin zur Nanoskopie, welche sich der Fluoreszenz bedient, um die physikalische Beugungsgrenze zu überwinden . Die einfachste Variante ist das Akquirieren des Fluoreszenzkanals mittels eines herkömmlichen Lichtmikroskops, welches mit einem Fluoreszenzfilter ausgestattet ist. Beim Standard für die 3D-Bildakquise, der Konfokal-Mikroskopie, wird nur ein sehr kleiner Teil des Präparats zu jedem Zeitpunkt zur Fluoreszenz angeregt. Dies ermöglicht das Abrastern der Proben und so das Rekonstruieren von 3D-Modellen im Rechner. Das Abrastern benötigt jedoch Zeit und somit ist das Akquirieren von zeitlichen Veränderungen schwierig bzw. die zeitliche Auflösung oftmals zu begrenzt. Eine weitere wichtige Mikroskopie-Technik, die sich der Fluoreszenz bedient und beim Zebrabärbling Anwendung findet, ist die Single Plane Illumination Microscopy (SPIM) . Hierbei ist das Prinzip ähnlich wie bei der Konfokal-Mikroskopie. Allerdings wird nicht lediglich ein Punkt zur Fluoreszenz angeregt, sondern ein scharf definiertes Lichtvolumen. Durch das hohe Aspektverhältnis des Volumens wird auch von einem Lichtblatt gesprochen. Diese Variante ermöglicht eine wesentlich höhere Akquisegeschwindigkeit bei einem guten Signal-Rausch-Verhältnis.
  Relevante Forschungsgebiete für eine bildbasierte Hochdurchsatz-Untersuchung im Zebrabärbling
  Der Vorteil, den eine Hochdurchsatz-Untersuchung im gesamten Organismus gegenüber der Zelle hat, ist, dass Verknüpfungen und Gene in den Organismen oft redundant vorkommen oder erst durch das Zusammenspiel aller biochemischen Prozesse in der Wirkkette der Einfluss von Chemikalien aussagekräftig erforscht werden kann. Der Zebrabärbling vereint die beschriebenen Möglichkeiten der Bildakquise mit den oben dargelegten Vorteilen in Haltung, gentechnischer Relevanz, kurzen Generationszyklen und klaren Mikroskopieaufnahmen. Somit erscheint das Tier als optimal geeignet für neue Hochdurchsatz-Untersuchungen mit bisher nicht erreichter Aussagekraft . Des Weiteren existieren bereits Firmen, welche spezielle Hochdurchsatz-Untersuchungen auf Auftragsbasis zur Entwicklung von Medikamenten am Zebrabärbling durchführen. Eine Liste von kommerziellen Anbietern von Hochdurchsatz-Untersuchungen findet sich in .
  Bezüglich der Einsatzgebiete für Hochdurchsatz-Untersuchungen lassen sich drei weitläufige und biologisch relevante Bereiche unterscheiden:
  Entwicklungsbiologische oder genetische Forschung: Hier wird das Verständnis über Funktionen und Eigenschaften von Genen und Mutationen erforscht. Die entwicklungsbiologische Forschung oder Ontogenese (aus dem Griechischen für Wesen Geburt Entstehung) beschäftigt sich mit den Vorgängen des Wachstums und der Entwicklung einzelner Organismen. Sie hat ihren Ursprung in der Embryologie. Im Hochdurchsatz lassen sich die genetische Kontrolle von Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Zellspezialisierung in verschiedenen Zelltypen und Organen erforschen. Hierbei werden diverse Techniken wie Forward Genetics und Reverse Genetics angewandt . Damit ist es beispielsweise möglich, gezielt die Expression von Genen auszulösen oder zu verhindern. Durch die Techniken lassen sich Einblicke in die Funktion und Wirkungsweise der Gene gewinnen. Das Potenzial von Hochdurchsatz-Untersuchungen im Zebrabärbling wir u.a. in aufgezeigt.
  Toxikologische Forschung: Hier wird der Einfluss von Chemikalien auf den Organismus erforscht und Substanzen bezüglich der Stärke ihrer Toxizität untersucht. Es existieren auch bereits Regularien, die den sog. Fisch Embryo Test (FET) beschreiben und festlegen, wie eine Hochdurchsatz-Untersuchung für toxikologische Versuche und Frischwasser-Untersuchungen durchgeführt werden soll . Der Test soll dazu dienen, eine Vielzahl von Tierversuchen an ausgewachsenen Fischen zu vermeiden. Die Toxizitäts-Tests müssen laut den gesetzlichen Vorschriften, wie sie in REACH . Bei pharmakologischen Hochdurchsatz-Untersuchungen
  • wird die Wirkung und das Wirkungsspektrum qualitativ und quantitativ ermittelt,
  • wird versucht, den Angriffspunkt sowie den Wirkungsmechanismus zu klären,
  • der Einfluss auf verschiedene Organfunktionen festgestellt, • die lokale und allgemeine Verträglichkeit geprüft und
  • auf toxische Effekte geachtet.
  Das Potenzial für Hochdurchsatz-Untersuchungen im Zebrabärbling auf diesem Gebiet wird ausführlich beschrieben in . Eine Übersicht, welche detektierbaren oder vergleichbaren Auswirkungen menschliche Krankheiten bzw. Krankheitserreger auf den Zebrabärbling haben sowie eine Tabelle wichtiger Forschungsarbeiten bietet .
  Grundlagen zur Bildakquise & -verarbeitung für den Hochdurchsatz
  Um eine Hochdurchsatz-Untersuchung durchzuführen, müssen, wie bereits in Abschnitt 1. Wird lediglich ein Sensorelement oder eine Reihe solcher verwendet, lassen sich eindimensionale Signale akquirieren. In pie mit einer zeitlichen Aufnahme kombiniert wie beispielsweise bei der SPIM -Methode (vgl. Abb. 1.6), so lassen sich vierdimensionale Datensätze aufzeichnen .
  I ∈ N I x ×I y mit i x , i y ∈ N und I (i x , i y ) < φ (1.1)
  Existierende Lösungsansätze
  Trotz den in Wirtschaft und Forschung weit verbreiteten, meist zellbasierten Hochdurchsatz-Untersuchungen existieren nur wenige Publikationen, die, basierend auf Zebrabärblingen, Hochdurchsatz-Untersuchungen realisieren. Aus der Erfahrung der zellbasierten Untersuchungen ist bekannt, dass sowohl die Durchführung der Hochdurchsatz-Untersuchung als auch deren Auslegung strukturiertes Vorgehen verlangt. Die wichtigsten Arbeiten und deren Vorgehensweise werden im Folgenden kurz zusammengefasst.
  Existierende bildbasierte Hochdurchsatz-Untersuchungen im Zebrabärbling
  In der Literatur sind verschiedene Ansätze zu finden, die das große Potenzial des Zebrabärblings für den Hochdurchsatz tatsächlich nutzen. Alle unterscheiden sich in der Art der Umsetzung, wie etwa dem Automatisierungsgrad oder der verwendeten Software. Es zeichnen sich bisher weder standardisierte Vorgehensweisen ab, noch hat sich eine Software etabliert. Zwar existiert in der Literatur eine freie, auf die Verwendung mit Zebrabärblingen spezialisierte Bildverarbeitungs-Software. Die Software befindet sich allerdings in einem sehr frühen Entwicklungsstadium und wurde seit 2009 nicht weiter aktualisiert .
  Alle veröffentlichten, bildbasierten Siebtest-Untersuchungen größeren Umfangs verfolgen ein eigens erstelltes Konzept mit einer eigens erstellten Bildverarbeitungsroutine oder benötigen eine kommerzielle und spezialisierte Plattform . Tabelle 1.2 bietet eine Auswahl an Hochdurchsatz-Untersuchungen, eine weitere Übersicht findet sich in .
  In den Untersuchungen von 2,5D + Fluoreszenz Tabelle 1.2: Ausgewählte Zebrabärblings-Untersuchungen im Hochdurchsatz oder mit Hochdurchsatz-Potenzial mit Anzahl an Fischen oder Substanzen (falls in der Veröffentlichung angegeben). Eine weitere ausführliche Übersicht und Gegenüberstellung bietet .
  angemerkt, dass in vorgeschlagen wird, solche Fingerprints mittels moderner cloudbasierter Techniken zu vernetzen.
  In führen die Autoren die Hochdurchsatz-Untersuchung zwar vollständig manuell durch, zeigen jedoch nur das Hochdurchsatz-Potenzial ihrer Methode auf, ohne derartige Versuche durchzuführen. Ziel ist es, einen mutierten Zebrabärbling zu identifizieren, dessen Phänotyp ein gekrümmter Rücken ist. Die Autoren stellen einen sehr einfachen Bildverarbeitungsalgorithmus vor, der in der Lage ist, den Rücken der Tiere zu finden und auf Krümmung zu prüfen. Bei zu dicht beieinander auftretenden Fischen versagt die Methode jedoch. Die Autoren vergleichen die Ergebnisse ihrer automatischen mit einer manuellen Analyse, kommen zu übereinstimmenden Ergebnissen und schließen so auf Hochdurchsatz-Fähigkeit des Verfahrens. Zur Steuerung der Mikroskope kommt die Software Metamorph zum Einsatz. Die Autoren machen keine Angabe, in welcher Software die Bildverarbeitung realisiert wurde.
  In wird die zurückgelegte Distanz von Zebrabärblingslarven sowohl bei Helligkeit als auch im Dunkeln gemessen. Die Vorbereitung der Larven erfolgt manuell, während die Bildakquise innerhalb einer kommerziell erhältlichen gekapselten Box der Firma Noldus ohne Verwendung eines Mikroskops erfolgt. Die Bilder werden lediglich mittels einer Industriekamera akquiriert. Die Bildverarbeitung erfolgt durch Verwendung einer Tracking-Software der Firma Noldus.
  Das Ziel der Autoren in ist die Durchführung einer Machbarkeitsstudie, um eine neue Automatisierungstechnik zur Analyse von Zebrabärblingen zur Verfügung zu stellen. Die Autoren stellen einen komplexen Apparat vor, der den Fisch innerhalb eines Schlauchs in einer Glas-Kapillaren transportiert, dort rotiert und währenddessen Bilder akquiriert. Durch die Akquise von allen Seiten wird das Problem der undefinierten Lage der Tiere gelöst, welches bei herkömmlicher Mikroskopie unumgänglich ist. Eine belastbare Anwendung der Konstruktion im Hochdurchsatz wurde bis zum heutigen Zeitpunkt jedoch noch nicht vorgestellt.
  In bedienen sich die Autoren eines automatisierten Mikroskops, wie es in vorgestellt ist. Es werden automatisiert mehrere Fluoreszenzkanäle akquiriert und es wird gezeigt, dass die Auswertung mittels eines automatisierten Skriptes erfolgen kann. Anders als in der Arbeit von wird hier nicht der gesamte Fisch in Regionen aufgeteilt, sondern es werden lediglich Regionen von Interesse im Fisch (sog. Neuromasten) erkannt und die Menge an Fluoreszenz gemessen. Ein Vergleich der automatisierten mit der manuellen Auswertung ergibt ähnliche Ergebnisse. Da die Bildverarbeitung nicht in der Lage ist, jede der manuell erkennbaren Regionen zu identifizieren, ist es notwendig, die Menge an untersuchten Fischen zu erhöhen, um zu gleichen Ergebnissen von manueller und automatischer Analyse zu kommen. Die Steuerung der Mikroskope sowie die Bildverarbeitung wurde mit Hilfe der Software Labview realisiert.
  KAPITEL 1. EINLEITUNG
  In werden Schlaf-und Aktivitätsphasen der Fische klassifiziert und sog. Verhaltensprofile erstellt. Die Profile werden für über 5 000 Substanzen ermittelt. Das Beobachten und Tracken der Fische erfolgt mittels einer kommerziell erhältlichen Box der Firma Viewpoint , welche wie in auf ein Mikroskop verzichtet, lediglich Hellfeld-Aufnahmen durchführt und eine Tracking-Software nutzt. Das Verhaltensprofil der mit Chemikalien exponierten Fische wird mit dem der unbehandelten Fische verglichen. Abweichungen können mittels eines Farbcodes visualisiert und gruppiert werden. Mit der vorgestellten Methode lassen sich ähnlich wirkende Substanzen schnell zusammenfassen.
  In werden Fische mittels eines Stimulus zu einer Bewegung animiert. Während des Experiments wird die Bewegung der Fische durch ein automatisches Mikroskop der Firma Nikon und einer Kamera aufgezeichnet. Die Synchronisierung der Hardware sowie die Bildauswertung erfolgt mittels der Software Metamorph . Es werden über 14 000 Substanzen geprüft und vergleichbar zu wird eine Gruppierung der Substanzen vorgenommen, die auf einem Vergleich der Auswirkungen der Substanzen basiert.
  In wird eine Bildanalyse bereits während der Bildakquise eingebunden. Dies hat den Vorteil, dass nicht relevante Strukturen oder Proben aussortiert werden können, wohingegen Bereiche im Fisch von Interesse in hoher Auflösung akquiriert werden. Die Mikroskopsteuerung und Bildverarbeitung erfolgt vollständig mittels einer skriptbasierten speziellen Kombination aus XML-Dateien und Labview -Skripten 10 .
  In werden Larven durch ein automatisches System vorbereitet und mit Nanopartikeln beaufschlagt. Aus einer Reihe von Merkmalen, die aus den Bildern extrahiert werden, lassen sich drei verschiedene Endpunkte automatisch identifizieren. Das System wird an ca. 1000 Embryonen demonstriert. Die Erfolgsquote liegt bei über 90% .
  In werden Larven automatisiert durch Injektion mit Tuberkulosebakterien infiziert. Es wird ein technisch realisierbarer Durchsatz von 2000 Larven pro Stunde angeführt. Das kommerzielle COPAS System wird zur Analyse der Daten verwendet.
  In findet ein kommerzielles hochspezialisiertes Auswertesystem für Mikrotiterplatten (Tecan Infinite M1000) Anwendung. Es wird ein theoretisch sehr hoher Durchsatz von über 50000 Einheiten pro Tag angegeben. Das System ist allerdings beschränkt auf Auswertungen in Fluoreszenzaufnahmen.
  Die vorgestellten Hochdurchsatz-Untersuchungen am Zebrabärbling sind bislang oftmals noch auf manuelle Schritte bei der Versuchsvorbereitung angewiesen. Es existieren jedoch bereits automatische robotergestützte Verfahren, deren Ziel es ist, eine vollständige Automatisierung der Vorbereitung der Untersuchungen zu ermöglichen. Um DNA, RNA oder Proteine in Zebrabärblingseier einzubringen, wird beispielsweise die Mikroinjizierung angewandt . Der Vorbereitungsschritt wurde bereits mehrfach durch automatisierte Systeme gelöst . Ebenso existieren Lösungsansätze zur automatischen Bestückung der Mikrotiterplatten sowie der automatischen Entfernung des Chorions, welches die Zebrabärblingseier umgibt .
  Einige der Veröffentlichungen beschäftigen sich speziell mit der Analyse des Herzschlags im Zebrabärbling. Anders als die in Tabelle 1.2 aufgeführten Publikationen beschränken sich die Untersuchungen auf die methodische Durchführbarkeit etwa durch Extraktion des Signals der roten Blutkörperchen aus Hellfeld-Aufnahmen oder die Detektion des Herzschlags ohne ein Markieren des Herzens bzw. der Zellen . Sie erfordern zumeist ein exaktes Positionieren der Larven . Allen ist gemein, dass bisher keine systematische Analyse in größerem Umfang durchgeführt wurde, was meist auf die komplizierten manuellen Präparationsschritte zurückgeführt werden kann. Somit war ein Einordnen in die Tabelle 1.2 nicht möglich.
  Es existieren eine ganze Reihe weiterer Ansätze, von denen hier nur auf eine Auswahl der wichtigsten eingegangen werden konnte. Dabei wurden vor allem die jüngeren Veröffentlichungen aufgeführt und solche, die eine hohe Stückzahl bzw. einen hohen Durchsatz erzielen.
  Offene Probleme
  Zusammenfassend ergibt sich aus den vorangegangenen Abschnitten die Erkenntnis, dass der Zebrabärbling nach übereinstimmender Meinung vieler Autoren erhebliches Potenzial für den Hochdurchsatz besitzt. Offensichtlich ist jedoch, dass aufgrund einer Reihe offener Probleme bisher nur ein geringer bis mittlerer Durchsatz erzielt werden konnte. Die wesentlichen technischen Probleme, weshalb Hochdurchsatz-Untersuchungen im Zebrabärbling bisher scheitern, sind:
  1. Entwurf der Hochdurchsatz-Prozesskette:
  Bisher existiert kein systematisches Entwurfskonzept einer Hochdurchsatz-Prozesskette. Alle publizierten Ansätze versuchen lediglich, manuelle Schritte teilweise oder ganz zu ersetzen. Die technischen, logistischen und informationstechnischen Voraussetzungen sind bei einer Anzahl von mehreren tausend Versuchen pro Tag jedoch komplex, daher bedarf es einer strukturierten Planung.
  Auswahl der geeigneten Art der Datenakquise:
  Die Wahl der Art der Datenakquise aller in der Literatur vorhandenen Lösungsansätze basiert im Wesentlichen auf der Erfahrung und dem Equipment, welches dem Entwickler zur Verfügung steht. Entscheidende Vor-und Nachteile der einzelnen Methoden werden nicht oder nur unzureichend berücksichtigt bzw. ausgeschöpft.
  Dies führt zu ineffizienter Datenakquise, oft unzureichenden Daten oder zu Datenvolumina, die ohne entsprechendes Fachwissen nicht zu bewältigen sind. Eine bildbasierte Hochdurchsatz-Untersuchung besteht üblicherweise aus zwei aufeinander folgenden Teilschritten (vgl. Abb. 2.2): Der erste Teil, die " Biologie & Bildakquise", setzt sich zusammen aus einer "
  Entwicklung und
  Versuchsplanung", gefolgt von der " Vorbereitung" der Proben und der "
  Datenerfassung". Der zweite Teil, die " Analyse & Interpretation", besteht aus der "
  Datenverarbeitung" sowie deren " Evaluation". Das vorgestellte Konzept ermittelt die Parameter aller in Abb. 2.2 dargestellten Blöcke. Der Informations-bzw. Datenfluss verläuft von links nach rechts, während die Parameter auf alle Blöcke Einfluss nehmen und daher übergeordnet sind. Wichtig hierbei ist die Einflussnahme und Berücksichtigung der Auswerte-und Versuchsparameter aufeinander, was durch den Doppelpfeil zwischen den Parameterblöcken visuell verdeutlicht wird.
  Die Versuchsplanung im Block "
  Biologie & Bildakquise" steht für die statistische Versuchsplanung. Das Vorgehen bei der statistischen Versuchsplanung sollte sich an der entsprechenden Fachliteratur orientieren und die Prinzipien der Wiederholung, Randomisierung und Blockbildung berücksichtigen Evaluation". Aus der automatischen Klassifikation muss der Biologe manuell eine Schlussfolgerung ziehen. Hierbei ist eine übersichtliche Präsentation der Versuchsergebnisse hilfreich. Die anhand der Präsentation getroffene Deutung des Biologen soll die Fragestellung der Hochdurchsatz-Untersuchung beantworten. In den Vorversuchen muss nach der ersten Evaluation anhand der vorläufigen Ergebnisse abgewogen werden, ob die Qualität der Ergebnisse ausreichend ist, um den Versuch auf die finale Größe zu skalieren, d.h. ob mit dem gewählten Verfahren die gewünschten Daten aussagekräftig abgebildet werden können und ob das gesuchte Nutzsignal in den Daten stark genug vorhanden ist. Ist dies der Fall, wird mit der tatsächlichen Durchführung des vollständigen Versuchs begonnen.
  Mit dem dargestellten Konzept steht nun eine einheitliche Vorgehensweise und Schnittstelle für die Versuchsauswertung zur Verfügung.
  Anforderungen an bildbasierte
  Hochdurchsatz-Untersuchungen Ist die auszuwertende Beobachtung beispielsweise in Hellfeld-Aufnahmen und in Gewebeflächen der Larve zu finden, so ist eine einzelne Mikroskopaufnahme bereits ausreichend, um die weiteren Schritte erfolgreich abzuschließen. Ist die Aufnahme ein Grauwertbild, so bleibt die vom Detektor aufgezeichnete Matrix zweidimensional. Für Farbbilder sind bereits drei Kanäle (für rot, grün und blau) aufzuzeichnen. Tritt der biologische Effekt lediglich unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie in Erscheinung, so kann ebenfalls ein zweidimensionales Bild akquiriert werden. Oft ist jedoch die Zuordnung des fluoreszierenden Bereichs im Hellfeld-Kanal gewünscht, was die Dimension der Akquise mindestens um einen Grad erhöht. Zu Beginn der Akquise der Hochdurchsatz-Untersuchung werden somit Modalität bzw. die Anzahl der Kanäle des Bildstroms festgelegt. Hierbei stehen die in der Einleitung (Abschnitt 1.2.2) beschriebenen Möglichkeiten zur Verfügung.
  Für eine Hochdurchsatz-Untersuchung bieten sich in erster Linie Hellfeld-Aufnahmen an, da solche traditionell der Standard in der Mikroskopie und daher weit verbreitet sind. Des Weiteren steht eine große Auswahl an (teil)automatisierten Mikroskopen zur Verfügung. Sie können zur oberflächlichen Abbildung fast aller Objekte verwendet werden. Es lassen sich der Zebrabärbling als Ganzes oder auch Bereiche, wie z.B. dessen einsehbare Organe akquirieren. Eine besondere Schwierigkeit ist das (automatische) Auffinden der Fokusebene, welche das Nutzsignal optimal abbildet. Die optimale Schärfe der Zebrabärblingslarven im Chorion ist unter mehreren Gesichtspunkten schwierig zu ermitteln. Für jedes Mikroskop kann der scharf abgebildete Bereich, die sog. Schärfentiefe, aufgrund der physikalischen Gegebenheiten (Auflösung/Numerische Apertur) errechnet werden. Bei hinreichend ebenen Objekten wird daher der gesamte Bereich scharf abgebildet. Da das Chorion jedoch eine relativ große Ausdehnung in der Tiefe hat, lässt sich in jeder Fokusebene nur ein kleiner Teil scharf darstellen. Zwar können z.B. immer die Mitte oder der obere Bereich scharf fokussiert werden, da die Lage der Larven jedoch variiert, ist immer ein anderer morphologischer Bereich der Larve scharf abgebildet. Um das Nutzsignal später vergleichen zu können, muss es jedoch auch möglichst gleich akquiriert sein. Werden nun verschiedene z-Ebenen aufgenommen, sog. Stacks, muss dasjenige ausgewählt werden, welches die interessierende Region möglichst scharf wiedergibt. Eine Vergrößerung der Anzahl an Fokusebenen ergibt jedoch nur so lange Sinn, wie die Summe der Schärfentiefen in den Bildern nicht den Durchmesser des Chorions des Zebrabärblings überschreitet. Erweitern lassen sich die Multikanalaufnahmen durch das Hinzufügen weiterer Fluoreszenzkanäle, da bei einer Hochdurchsatz-Untersuchung mehrere Zellen unterschiedlich markiert sein können. Dies können sowohl Autofluoreszenzkanäle als auch markierte Kanäle unterschiedlicher Emissionswellenlängen sein. Je akquirierter Fluoreszenzwellenlänge ist ein gesonderter Kanal aufzuzeichnen und für eine Hellfeld-Aufnahme ein weiterer (bzw. drei für Farbaufnahmen). Bei der Akquise solcher Multikanalaufnahmen entstehen somit schnell große Datenmengen, da sich hier die Datenmenge zusätzlich zu den Abtastzeitpunkten nochmals mit der Kanalanzahl multipliziert. Es sei darauf hingewiesen, dass sich Zellen biologisch oft nicht sofort markieren lassen. Sog. transgene Linien, die sich für diesen Zweck eignen, müssen erst gezüchtet werden. Das Züchten führt zu einer Wartezeit eines oder mehrerer voller Generationszyklen der Fische. Zudem muss beachtet werden, dass für eine Hochdurchsatz-Untersuchung eine entsprechend große Population der transgenen Linie vorhanden sein muss, um den Nachschub an Eiern pro Tag zu gewährleisten, was zu weiteren Wartezeiten führen kann.
  Bei der 3. Dimension kann entweder die Hinzunahme der Zeit oder die geometrische Ausdehnung in Richtung der z-Achse gemeint sein. Zur Vermeidung von Missverständnissen werden in der vorliegenden Arbeit nur räumliche Bildströme von Zebrabärblingslarven als dreidimensional bezeichnet, ansonsten wird von Abtastzeitpunkten gesprochen. Wie bei den 2.5-dimensionalen Aufnahmen erweitert sich der Bildstrom bezüglich der z-Achse und alle Pixel werden zu Voxeln. Allerdings ist bei solchen Daten im Gegen-satz zu 2.5-dimensionalen Bildströmen eine Volumeninformation gegeben, da die verdeckt liegenden Bereiche im Fisch ebenfalls abgebildet werden können. Es steigen jedoch die Anforderungen an die Computer-Hardware sowohl durch den größeren Speicherplatzbedarf als auch in der Auswertung, da die Volumenbilder meist als Ganzes in den Arbeitsspeicher geladen werden müssen.
  Die größten Bildströme entstehen bei der Kombination von Multikanalaufnahmen mit dreidimensionalen Aufnahmen. Solche n-dimensionalen Datensätze lassen sich mit dem sog. SPIM Mikroskop aufzeichnen (vgl. Abschnitt 1.2.2). Für die Hochdurchsatz-Untersuchung bleibt die Verarbeitung hoch-dimensionaler Bilddaten jedoch zum Zeitpunkt des Entstehens der vorliegenden Arbeit nur eine theoretische Möglichkeit, da sowohl die Datenakquise, die Rechenleistung und die Speicherkapazitäten solche Datensätze für den Hochdurchsatz ausschließen.
  Einen Kompromiss bietet CAM (Computer Aided Microscopy) . Mittels der CAM-Technologie wird ein Übersichtsbild oder ein dreidimensionales Bild in niedriger Auflösung aufgenommen, live ausgewertet und lediglich der Bereich von Interesse akquiriert, beispielsweise mit Hilfe eines Zoomobjektives. Der in sehr hoher Auflösung und ggf. Multikanaltechnik akquirierte Bereich beschränkt sich hierbei möglichst lediglich auf den Bereich im Zebrabärbling, der die Nutzsignalinformation trägt. Bei der Evaluation muss ein Biologe die präsentierten Daten entsprechend interpretieren. Die Deutung geschieht fast ausschließlich manuell. Für bekannte Effekte lässt sich jedoch eine Plausibilitätsprüfung oder eine automatisierte Gegenprobe einführen, welche eine Sicherheit gegenüber Fehlauswertungen bietet. Die Ergebnisse müssen schließlich archiviert werden, um zu einem späteren Zeitpunkt eine Reproduktion der Ergebnisse zu ermöglichen.
  Analyse und Interpretation
  Einfluss der Versuchsparameter auf die Bildqualität
  Die für Hochdurchsatz-Untersuchungen geforderten Parameter wie z.B. möglichst kurze Gesamtzeit der Versuchsdurchführung haben zur Folge, dass die Bildakquise automatisiert durchgeführt werden muss. Hierfür finden die im vorigen Abschnitt erwähnten speziellen Hochdurchsatz-Mikroskope Anwendung. Die schnelle Akquise führt jedoch leicht zu Inho-mogenitäten in den Bildströmen, da die Aufnahmen ohne menschliche Überwachung oder Korrektur durchgeführt werden. Solche Inhomogenitäten beeinflussen die Bildqualität und -information. Die Bildverarbeitung und Klassifikation muss entsprechend abgestimmt werden . Zur Betrachtung der Auswirkungen auf die Bildauswertung lassen sich die Inhomogenitäten in zwei Bereiche einteilen: Die Anzahl an untersuchten Zebrabärblingslarven setzt sich zusammen aus drei Klassen. Die Klasse der Positiv-Kontrollen bestehend aus n C + Versuchseinheiten, die der Negativ-Kontrollen bestehend aus n C − Versuchseinheiten und die Klasse der den Rahmenbedingungen ausgesetzten Proben bestehend aus n s Versuchseinheiten. Die Anzahl an Zebrabärblingslarven in der Hochdurchsatz-Untersuchung ist dann gegeben durch:
  n = 1 . . . N mit N = n C + + n C − + n s , N ∈ N + . (2.1)
  Die Versuchseinheit wird durch Größen beschrieben, die die Versuchsbedingungen bestimmen. Die Größen werden in Anlehnung an 
  Y =    y 1 [1] • • • y s y [1]
  . . . . . . . . .
  y 1 [N ] • • • y s y [N ]    , Z =    z 1 [1] • • • z s z [1] . . . . . . . . . z 1 [N ] • • • z s z [N ]    .
  (2.2)
  Zum besseren Verständnis sei als Beispiel eine Hochdurchsatz-Untersuchung angeführt, in welcher Zebrabärblingseier nach Koaguliertheit und Herzschlag untersucht werden sollen und welche an zwei Mikroskopen und an unterschiedlichen Tagen aufgenommen wurde. In diesem Beispiel sind die Zebrabärblingseier die Versuchseinheiten. Der Herzschlag sowie die Koaguliertheit sind die Planfaktoren, mit jeweils m y,1 = m y,2 = 3 Klassen, 
  y 1 [n] = {1, 2, 3}, y 2 [n] = {1,Ψ n = f (p Ψ ) n (2.12) mit (p Ψ ) n = (m Ψ ; u Ψ ; t Ψ ; f Ψ ) T n .
  (2.13) Gut gewählte Akquise-Parameter des Bildstroms bilden also möglichst ausschließlich das Nutzsignal ab.
  Der mit genannten Parametern akquirierte Bildstrom BS setzt sich aus Einzelbildern I E zusammen, welche jeweils durch eine Matrix von Intensitätswerten beschrieben werden:
  I E [i f , i w ] n ∈ N I x ×I y ×I z , (2.14) i w , i f ∈ N.
  Hierbei ist i f = 1 . . . r F der Index aller Abtastungen und i w = 1 . . . r w der Index der Wiederholungen. Weiter ist I x die Auflösung des Bildes in xund I y die Auflösung des Bildes in y-Richtung, i z = 1 . . . I z der Index für Schichtaufnahmen bzw. Fokusebenen und i c = 1 . . . I c , der Index der Modalitäten. Der gesamte Bildstrom lässt sich somit schreiben als:
  BS n =    I E [ 1, 1] • • • I E [ 1 , r w ] . . . . . . . . . I E [r F , 1] • • • I E [r F , r w ]    i c ,n ,(2.15
  BS n ∈ N I x ×I y ×I z ×I c ×r F ×r w , i c , r F , r w ∈ N.
  Es ergeben sich die Bild-Rohdaten des Bildstroms BS mit insgesamt B Bildern.
  B = I c • I z •r w •r F . (2.16)
  Der Einfluss der Bildstromparameter ist anschaulich in Abb. 2.10 dargestellt.
  1 2 r w Bildsequenzen 1 2 r w I C 2 [1] [2] [r F ] 1 2 r w 1 Modalität Bildsequenzen [r F ] Frames je Bildsequenz
  Bildsequenzen Modalität Modalität Abbildung 2.10: Grafische Veranschaulichung eines Elementes des Bildstroms BS n In vielen Fällen ist eine Vorverarbeitung des Bildstroms sinnvoll oder notwendig. In einer Bildvorverarbeitung werden z.B. Extended-Fokus-Bilder berechnet (vgl. Abschnitt 1.2.2) oder es werden Punktoperationen wie Histogrammanpassungen oder Korrekturen des Gammawertes vorgenommen. Ebenso fallen alle linearen und nichtlinearen Bildfilter-Operatoren in den genannten Bereich. Die Bildvorverarbeitung wird hier allgemein beschrieben als eine Abbildung des Bildstroms BS auf einen für die weitere Verarbeitung verbesserten Bildstrom BS * , welche von einem oder mehreren Filterparametern p f n abhängt. Die Parameter p f n sind z.B. die gewählten Filtermasken, Schwellenwerte usw. Der Aufbau von BS * ist hierbei analog zu Formel (2.15)
  S RV 2 (p f n ) : BS → BS * .
  (2.17) Im Allgemeinen ist eine Dimensionsreduktion der Daten beabsichtigt. In speziellen Fällen steigt die Dimension jedoch auch an, z.B. wenn es notwendig ist, neue Bilder zu berechnen. Bildfusionen hingegen führen immer zu einer Dimensionsreduktion.
  Die Bildverarbeitung hat nun die Aufgabe, das Nutzsignal Ψ in jedem Bild aus dem Bildstrom BS zu extrahieren oder zu segmentieren. Die Segmentierung S RV 3 bildet somit
  BS * auf Ψ ab S RV 3 (p ψ ) : BS * → Ψ =    I E Ψ [ 1 , 1] • • • I E Ψ [ 1 , r wΨ ] . . . . . . . . . I E Ψ [r F Ψ , 1] • • • I E Ψ [r F Ψ , r wΨ ]    i cΨ ,n ,(2.18)
  Ψ n ∈ N I xΨ ×I yΨ ×I zΨ ×I cΨ ×r F Ψ ×r wΨ .
  (2.19)
  Hierin sind I E Ψ Ausschnitte jedes Einzelbildes I E des originalen Bildstrom, welche nun möglichst nur das Nutzsignal enthalten
  I E Ψ [i f , i w ] n ∈ N I xΨ ×I yΨ ×I zΨ ,(2.20
  ) 
  i wΨ , i f Ψ ∈ N.S Ψ 1 (p SΨ 1 ) : Ψ → Y Z R =    y Z R [ 1, 1] • • • y Z R [ 1 , r w ] . . . . . . . . . y Z R [r F , 1] • • • y Z R [r F , r w ]    m 1 ,(2.23)Y Z R ∈ R r F ×r w ×m 1 .
  Die Fisch-Informationszeitreihen werden durch eine Dimensionsreduktion wiederum mittels Merkmalen beschrieben. Es entsteht schließlich ein m 2 -dimensionaler Merkmalsraum in Abhängigkeit der Parameter p SΨ 2 . Solche Merkmale werden für die Hochdurchsatz-Untersuchung Fisch-Informationsmerkmale genannt
  S Ψ 2 (p SΨ 2 ) : Y Z R → x T = x 1 , . . . , x m 2 ,
  (2.24)
  x ∈ R 1×m 2 (2.25)
  Die extrahierten Merkmale sind häufig redundant oder enthalten z.T. keine Information, die sich für eine Klassifikation eignet. Daher wird eine Merkmalsauswahl angewandt, die sich eines Kriteriums bedient, um die aussagekräftigsten Merkmale zu identifizieren. Eine Übersicht zu solchen Kriterien ist in zu finden. Der Bezeichner I steht für die Indexmenge der ausgewählten m 3 Merkmale und es ergibt sich die Abbildung
  S Ψ 3 : x → x| I = x 1 , . . . , x m 3 ,(2.26
  ) • Anforderungen an die Durchführung,
  x| I ∈ R 1×m 3 , m 2 ≥ m 3 .
  Die Merkmalsaggregation dient zur
  RV S y − → ŷ = RV S RV 1 − −− → BS S RV 2 − −− → BS * S RV 3 − −− → Ψ S Ψ 1 −−→ Y Z R S Ψ 2 −−→ x S Ψ 3 −−→ x|I S Ψ 4 −−→ w S Ψ 5 −−→ ŷ (2.31) RV S z − → ẑ = RV S RV 1 − −− → BS S RV 2 − −− → BS * S RV 3 − −− → Bildverarbeitung Ψ S Ψ 1 −−→ Y Z R S Ψ 2 −−→ x S Ψ 3 −−→ x|I S Ψ 4 −−→ w S Ψ 5 −−→ ẑ Merkmalsextraktion/Klassifikation . (2
  • Anforderungen an die Messung, • das Nutzsignal robust abbilden,
  • ein gutes Nutzsignal-Rausch-Verhältnis aufweisen,
  • die Probe wenig beeinflussen,
  • dem Abtasttheorem gerecht werden.
  Die Prüfung kann weitgehend durch einfaches Ansehen der Bilder erfolgen. Sind die auszuwertenden Bereiche beispielsweise ein Gewebe in der Larve, so ist auf einen guten Kontrast dieser Bereiche zu achten. Beim Überprüfen der gewählten Abtastfrequenz und bei mit niedriger Frequenz auftretenden Nutzsignalen muss deren Frequenz zuvor mittels entsprechender Messeinrichtungen ermittelt werden. Eine möglichst vollständige Repräsentation des Nutzsignals im akquirierten Bildstrom muss angestrebt werden. Die große Bandbreite an möglichen biologischen Effekten und damit Nutzsignalen lässt eine allgemein gültige Prüfmethode nicht zu. Die Erfahrung zeigt jedoch, dass sich Daten qualitativ für eine automatische Auswertung eignen, wenn es einem ungeübten menschlichen Betrachter möglich ist, das Nutzsignal im Bildstrom leicht zu identifizieren und ggf. zu markieren. Andernfalls muss eine alternative Methode zur Bildakquise angewandt werden oder der biologische Effekt muss verworfen werden (vgl. Abb. 
  Nutzsignalzeitreihen
  Instantan Eingang der Modulkategorie Bildstrom-Vorverarbeitung sind die Rohdaten, d.h. der unverarbeitete Bildstrom BS, wie er bei der Akquise aufgezeichnet wurde. Als Ausgang steht nach erfolgreicher Verarbeitung ein verbesserter Bildstrom BS * zur Verfügung, der sich für die Segmentierung eignet und dessen Dimension so groß wie nötig, jedoch so gering wie möglich ist.
  Nutzsignalmerkmale
  Auswahl von Zeitpunkten
  Der erste Unterpunkt der Bildstrom-Vorverarbeitung in Abb. Die Störgrößen sind hier u.a. das nicht vollständige Ausnutzen des zur Verfügung stehenden Wertebereichs, was zu einer schlechten Bilddynamik führt sowie abweichende Mikroskop-Einstellungen, das Rauschen des Detektors etc. Ein Unterdrücken des Einflusses der Störgrößen kann durch eine Korrektur der Intensitätswerte erfolgen. Hierbei wird jeder Pixel mittels des Parameters q zentriert und durch einen die Verteilung beschreibenden Parameter v dividiert. Für ein zweidimensionales Bild gilt:
  I * i x i y = I i x i y − q v .(3.1)
  Für die Parameter q und v eignen sich z.B. statistische Parameter wie Mittelwert oder Varianz der Intensitätswerte
  q 1 = 1 I x I y I x i x =1 I y i y =1 I i x i y , v 1 = 1 I x I y − 1 I x i x =1 I y i y =1 (I i x i y − q) 2 .
  (3.2) oder auch Quantile und Extremwerte Als Beispiel sei hier die Hochdurchsatz-Untersuchung zur Ermittlung der akuten Toxikologie gewählt . In Abb. 3.4 ist ein Scatterplot einer Hochdurchsatz-Untersuchung von 2436 Versuchseinheiten (hier jeweils ein Zebrabärbling) aufgetragen, welche an zwei unterschiedlichen Mikroskopen aufgezeichnet wurde. Ein typisches Merkmal zur Klassifikation der Bewegung wurde ausgewählt (vgl. hierzu Abschnitt 3.4.2). Der Einfluss der beiden Mikroskope ist deutlich, durch einen Offset der Merkmalswerte zueinander zu erkennen. Solche Einflüsse, wie sie in diesem Beispiel bereits zwischen zwei Mikroskopen des gleichen Typs entstehen, sind zwischen unterschiedlichen Laboren ungleich größer.
  q 2 = min i x =1...I x min i y =1...I y (I i x i y ) , v 2 = max i x =1...I x max i y =1...I y (I i x i y ) − min i x =1...I x min i y =1...I y (I i x i y ) .I * i x i y =      0 für I i x i y ≤ I tief I i x i
  Um Versuche auch zwischen unterschiedlichen Laboren, Mikroskopen und Tagen vergleichbar zu machen, muss der Bildstrom durch auf den Versuch bezogene Parameter normalisiert werden. Hier ist meist das Normalisieren mittels der Negativ-oder Positiv-Kontrollen erfolgreich . Im gezeigten Beispiel scheitert die Methode jedoch ebenfalls, da auch die Merkmalswerte in den Positiv-Kontrollen schwanken. Kontrollen sollten zwar ein vergleichbares Verhalten zeigen, was hier jedoch nicht der Fall ist, wie Abb. 3.5 zeigt. In der Abbildung wurden alle Merkmalswerte mittels der Kontrollen normiert. Insbesondere bei den Merkmalswerten von Mikroskop 1 (blau dargestellt) streuen nach der Normierung die Merkmalswerte stärker als zuvor. Beispielsweise haben die ersten 84 Versuchseinheiten (96 Versuche auf einer Platte davon 12 Kontrollen zur Normalisierung) nach der Normalisierung Merkmalswerte welche minimal etwa bei 0 liegen. Die nächste Platte (Nummer Versuchseinheit 84 bis 168) zeigt Minimalwerte unter -100. Klarer wird die unterschiedliche Verteilung der Merkmalswerte durch den Einfluss der Mikroskope in Abbildung 3.6, in der diese anhand eines Histogramms veranschaulicht wird. Die hier dargestellten Larven sind sich in beiden Aufnahmen (Reihenweise verglichen) sehr ähnlich, die Merkmalswerte (hier Schwerpunkt des Histogramms, x 1 vgl. Abschnitt 3.4.1) zeigen jedoch erhebliche Unterschiede. In einem konsistenten und normalisierten Versuch sollte sich wenig Unterschied bei der Merkmalsverteilung der gleichen Planfaktoren von vergleichbaren Versuchseinheiten zeigen, selbst wenn sie von unterschiedlichen Mikroskopen stammen. Bisherige Lösungen müssen einen solchen Datensatz verwerfen.
  Deshalb wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine neue Methode erarbeitet, welche in der Lage ist, ein solches Problem zu lösen und auch inhomogene Datensätze vergleichbar macht . Ein Klassifikator ist umso besser, je exakter der Klassifikator in der Lage ist, die Faktoren Ŷ oder Ẑ der wahren Klasse Y oder Z zuzuordnen. Es lässt sich die Erfolgsrate für Planfaktoren ξ y und Störfaktoren ξ z für jede Versuchseinheit n über alle Ausgangsklassen s y angeben durch:
  ξ y,n = 1 s y s y i s y =1
  ξ y,i s y ,n mit ξ y,i s y ,n = 1 ŷi s y ,n = y i s y ,n 0 sonst , (3.5)
  ξ z,n = 1 s z s z i sz =1 ξ z,i s z ,n mit ξ z,i s y ,n = 1 ẑi sz ,n = z i sz ,n 0 sonst . (3.6)
  Die mittlere Klassifikationsgüte ξ y , ξ z wird bestimmt durch:
  ξ y = 1 N N n=1 ξ y,n , ξ z = 1 N N n=1 ξ z,n .(3.7)
  Im Falle einer perfekten Klassifikation werden alle Planfaktoren korrekt der zugehörigen Ausgangsklasse zugeordnet, während sich die Klassen aller anderen Faktoren nicht trennen lassen und daher gleichverteilt nach dem Zufallsprinzip auf die Ausgangsklassen aufgeteilt werden:
  ξ y,ziel = 1, ξ z,ziel ≈ 1 s z s z i sz =1 1 m y,sz .(3.8)
  Die letzte Formel setzt allerdings voraus, dass die Merkmale von den Störfaktoren unabhängig sind, was in realen Systemen nicht der Fall ist. Daher müssen alle Parameter in p so gewählt werden, dass der Einfluss der Störfaktoren klein wird. Dieses Problem kann mittels Filter-oder Wrapperansätzen gelöst werden . Filter bestimmen die Versuchsparameter ohne Kenntnis der wahren oder geschätzten Klassenzugehörigkeit
  p * = f (p).
  (3.9)
  Wrapper hingegen berücksichtigen die Klassifikationsergebnisse bei der Parameteradaption:
  p * * = f (p, Y, Z, Ŷ, Ẑ).
  (3.10)
  Wrapper liefern üblicherweise bessere Ergebnisse auf Kosten eines deutlich höheren Rechenaufwands.
  Die Optimierung sucht nach einer Parameterkombination, welche einen Kompromiss zwischen ξ y − ξ y,ziel und ξ z − ξ z,ziel sucht.
  Ein mögliches Kriterium zur Optimierung ist vor Normalisierung .
  min p (O) mit O = α ξ y − ξ y,ziel + (1 − α) ξ z − ξ z,ziel , α ∈ [0.
  Kantenanzahl nach LoG-Algorithmus
  Mittlerer Grauwert der mittleren Bildzeile Abbildung 3.8: Merkmalsraum und Diskriminanzfunktion für zwei Platten aus Abbildung 3.4 nach der Normalisierung mittels des Wrapperansatzes . HOCHDURCHSATZ-UNTERSUCHUNGEN AM ZEBRAB ÄRBLING
  Segmentierung der Nutzinformation
  Um das biologische Nutzsignal einer Hochdurchsatz-Untersuchung quantifizieren zu können, muss es von allen anderen Daten im Bildstrom separiert werden. 
  Neue Methode zur Trennung von Einzelobjekt und Hintergrund
  Zur Trennung der Nutzsignalinformation einer einzelnen Versuchseinheit vom Hintergrund sind bei akzeptabler Bildqualität bereits Schwellenwertverfahren in Kombination mit morphologischen Operatoren erfolgreich . Adaptive Schwellenwertverfahren wie die Methode von Otsu oder Fuzzy-basierende Schwellenwertverfahren bieten hier jedoch deutlich robustere Ergebnisse 
  Differenzbilder
  Differenzbilder sind eine einfache Möglichkeit die Veränderung der Pixelwerte und damit die Bewegung der Zebrabärblingslarve in einem Bild darzustellen. Hierzu wird bei einer Bildsequenz das zeitlich später aufgezeichnete Bild vom vorhergehenden abgezogen. Um negative Pixelwerte zu vermeiden, wird der Absolutwert gebildet. Werden alle Bilder des Bildstroms BS nach dem Zeitpunkt der Akquise geordnet und wird sich zur einfacheren Notation hierbei auf lediglich eine Modalität I c = 1 und eine Schichtaufnahme I z = 1 beschränkt, so ergibt sich eine Zeitreihe I i x i y [k] mit k = 1 . . . K Abtastzeitpunkten. Für die Differenzbilder lässt sich dann schreiben:
  Ψ d [k] = |I[k] − I[k − 1]| mit k = 2 . . . K (3.12)
  Die entstandenen Differenz-oder Merkmalsbilder bilden die Basis für eine Vielzahl von Einzelmerkmalen, deren gemeinsames Ziel es ist, die Menge an Bewegung im gesamten Bild oder in Ausschnitten zu quantifizieren. Ein einzelnes Differenzbild aus einer solchen Zeitreihe wird im Folgenden mit I d bezeichnet.
  Nutzsignalzeitreihen und -merkmale
  Drei Typen von Nutzsignalen werden unterschieden: 
  x 1 = φ i h =0 i h • H (i h ) φ i h =0 H (i h ) .(3.13)
  wobei für das Histogramm H gilt: setzen und bei der Berechnung auszuschließen: Schwankung der Grauwerte entlang der mittleren Bildzeile" berechnen. Beide Merkmale sind ein guter Indikator für den Entwicklungsstand der Zebrabärblinge. Die Merkmale lassen sich weiter verbessern, wenn sie auf das Zentrum des segmentierten Bereichs einschränken werden, indem lediglich die mittleren 30% der mittleren Bildzeile ausgewertet werden:
  H (i h ) = card{(i x , i y )|I (i x , i y ) = i h } mit i h = 1 . . . φ, i h ∈ N. (3x 2 = I x i x =1 I y i y =1 I (i x , i y ) I x • I y − card{ (i x , i y ) | I (i x , i y ) = 0} . (3x 3 = n 2 i x =n 1 I i x , I y 2 n 2 − n 1 + 1 (3.16) mit gerundeten Werten n 1 = [0.3 • I x ] und n 2 = [0.7 • I x ].
  Die Schwankung um die mittlere Bildzeile lässt sich nach Korrektur um die mittleren Grauwerte c berechnen durch
  δ(i x ) = I (i x , I y 2 − c .
  (3.17)
  Nach Aufsummieren ergibt sich das Merkmal ebenfalls über den mittleren Bereich der mittleren Bildzeile
  x 4 = n 2 i x =n 1 δ(i x ).(3.18)
  Die Anzahl an Kanten in Kantenbildern ist ein guter Indikator für die Anzahl an ausgeprägten Details im Zebrabärbling und somit für die Vergleichbarkeit des Entwicklungsstandes. Die Algorithmen zur Kantendetektion " Canny" I Canny und " Laplacian of Gaussian (LoG)" I LoG wurden angewandt und ausgewertet:
  x 5 = card{(i x , i y ) | I Canny (i x , i y ) = 1}, (3.19) x 6 = card{(i x , i y ) | I LoG (i x , i y ) = 1}. (3.20)
  Es lassen sich weitere Merkmale ermitteln, indem das Aussehen der Objekte im Bild untersucht wird. Beispielsweise lässt sich die " Kugeligkeit" oder " Rundheit" des Bildinhalts des segmentierten Bildstroms bestimmen. Dafür wird nach Anwendung des ISO-Data Algorithmus die längste M max mit der kürzesten Halbachse M min der umschließenden Ellipse verglichen. (µ 11 , µ 22 , µ 12 ) sind hierfür die notwendigen zentralen Momente des gefilterten Bildes (vgl. ).
  M max = 2 • 2 • µ 11 + µ 22 + (µ 11 − µ 22 ) 2 + 4 •µ 2 12 .
  (3.21)
  M min = 2 • 2 • µ 11 + µ 22 − (µ 11 − µ 22 ) 2 + 4 •µ 2 12 .
  (3.22) (3.24)
  Auf Bewegungen bezogene Merkmale
  Alle Merkmale, die sich auf die Bewegung der Zebrabärblinge beziehen, wurden aus Differenzbildern extrahiert. Die Merkmale unterscheiden sich vornehmlich dadurch, dass sie unterschiedlichen Wert auf charakteristische Phänomene der Bewegungen der Larven, wie etwa lokal oder global auftretende Änderungen, legen.
  Ein geeignetes Merkmal ist die Standardabweichung in den Differenzbildern nach Formel (3.12):
  x 9 [k] = 1 I x I y − 1 I x i x =1 I y i y =1 I d ,i x i y [k] − I d [k] 2 (3.25) mit I d [k] = 1 I x I y I x i x =1 I y i y =1 I d ,i x i y [k].
  (3.26) Das Merkmal quantifiziert die Variation der Pixel im Differenzbild. Bei Bewegung steigt die Standardabweichung an. Eine Variante ist es, das Merkmal über die Anzahl der Pixel und die Farbtiefe φ (Die Farbtiefe wird üblicherweise bei der Bildakquise festgelegt) zu normalisieren:
  x 10 [k] = 1 I x I y φ I x i x =1 I y i y =1 I d ,i x i y [k] (3.27)
  Das Merkmal x 10 gibt Auskunft über die mittlere relative Änderung der Pixel.
  Um Differenzen innerhalb dunkler und heller Bildbereiche direkt vergleichbar zu machen, wird der Mittelwert über die Intensitätswerte der Pixel normalisiert. Um Divisionen durch Null zu vermeiden, wird eine Konstante x off im Nenner addiert:
  x 11 [k] = 1 I x I y I x i x =1 I y i y =1 I d ,i x i y [k] I max,i x i y [k] + x off (3.28) 76 KAPITEL 3. MODULKATALOG F ÜR DIE AUSWERTUNG UND PR ÄSENTATION VON HOCHDURCHSATZ-UNTERSUCHUNGEN AM ZEBRAB ÄRBLING mit I max,i x i y [k] = max(I i x i y [k], I i x i y [k − 1]). (3.29)
  Stark bewegte Regionen im Bild lassen sich quantisieren, wenn die Anzahl relevanter Pixeländerungen im Differenzbild bestimmt wird. Dazu werden Pixel gezählt, die Differenzen größer als ein dynamischer Schwellenwert I dyn aufweisen: 
  x 12 [k] = card i x ,i y (I d ,i x i y [k]|I d ,i x i y [k] > I dyn [k])(3I d yn [k] = I * d [k] + 3s * d [k] (3.31)
  Durch Bildrauschen entstehen Ausreißer im Differenzbild mit Werten oberhalb eines mittels des c-Quantils über den Pixelwerten des Bildes gebildeten Schwellenwertes I quant c oder unterhalb eines mittels des (1-c)-Quantils über den Pixelwerten des Bildes gebildeten Schwellenwertes I quant 1−c . Ihre Pixelwerte lassen sich bestimmen durch:
  {(i x , i y )} = {(i x , i y )|I quant c < I d ,i x i y < I quant 1−c }, 0 ≤ c < 0.5.(3.32)
  c muss hierbei kleiner sein als der Anteil der maximal im Bild auftretenden Bewegung. Ein Wert von c=0.4 hat sich in der Praxis bewährt. Damit ergibt sich 
  s * d [k] = 1 (1 − c)I x I y − 1 (i x ,i y )|c<I d ,i x i y <1−c (I d ,i x i y [k] − I * d ,i x i y [k]) 2 (3.33) mit I * d ,i x i y [k] = 1 (1 − c)I x I y − 1 (i x ,i y )|c<I d ,i x i y <1−c I d ,i x i y [k] (3I x I y anstelle von I d ,i x i y [k].
  x 13 [k] = card (i x , i y )
  I d ,i x i y [k] I x I y > I dyn [k] (3.35)
  Die maximale Änderung im Differenzbild ist ein Maß für die stärkste Bewegung der Zebrabärblingslarve:
  x 14 [k] = max i x ,i y (I d ,i x i y [k])(3.36)
  Eine Variante des Merkmals x 14 ist es, das Merkmalsbild zuvor mit einem 3x3 Gaußfilter (Maximum im geglätteten Differenzbild) zu falten. Dies reduziert den Einfluss einzelner Ausreißer im Differenzbild. Es hat sich bewährt für σ 0.5 zu wählen:
  h(i x , i y ) = exp − i 2 x + i 2 y 2σ 2 :
  (3.37)
  x 15 [k] = max I x ,I y (I d ,smoothed,i x i y [k])(3.38)
  mit 
  I d ,smoothed,i x i y [k] = I d ,i x i y [k] * h(i x , i y ). (3x 16 [k] = 1 x 9 [k] I x i x =1 I y i y =1 I d ,i x i y [k] (3.40)
  Wichtig bei einer solchen Normalisierung ist jedoch ein vergleichbarer Bildinhalt. Ist in den Bildern beispielsweise eine variierende Anzahl an Eiern abgebildet, so scheitert die Methode.
  Die einfachste Form zur Ermittlung der Bewegung im Differenzbild ist die Summe aller Änderungen, ohne jegliche Normalisierung nach:
  x 17 [k] = I x i x =1 I y i y =1 I d ,i x i y [k]
  (3.41) Zur automatischen Merkmalsauswahl kommen verschiedene bekannte Methoden zum Einsatz. Beispiele sind die univariate Varianzanalyse (ANalysis Of VAriance -ANOVA) und die multivariate Varianzanalyse (Multivariate ANalysis Of VAriance -MANOVA) . Die Verfahren vergleichen die Innerklassenvarianzen mit den Zwischenklassenvarianzen der Merkmale und geben so Aufschluss darüber, welches Merkmal oder welche Merkmalskombination am besten zur Unterscheidung der gewählten Klassen geeignet ist. Mit Hilfe der ANOVA wird das Merkmal identifiziert, dessen Relevanz zur Klassentrennung den höchsten Wert erreicht. Daraufhin wird das identifizierte Merkmal, mit Hilfe der MANOVA, mit allen verbliebenen Merkmalen kombiniert, die Relevanz der Merkmalskombination ermittelt und die beste Zweier-Merkmalskombination bestimmt. Der Schritt entspricht der Formel (2.26) und Formel (2.27). Es hat sich in der Praxis bei Hochdurchsatz-Untersuchungen bewährt, den Merkmalsraum auf eine solche Zweier-Merkmalskombination zu reduzieren und zur Klassifikation heranzuziehen. Eine solche Zweier-Merkmalskombination ist ein guter Kompromiss zwischen Interpretierbarkeit, Rechenzeit und Güte der Klassifikation .
  Auf Signalstärke bezogene Merkmale
  Merkmalsauswahl
  Auswertung und Klassifikation
  Nach Auswahl geeigneter Module zur Extraktion von informationstragenden Merkmalen sind mit der formulierten Fragestellung aus Abschnitt 2.6 alle notwendigen Voraussetzungen für eine erfolgreiche Lösung eines Klassifikations-oder Regressionsproblems in Hochdurchsatz-Untersuchungen am Zebrabärbling gegeben. Zur Klassenzuordnung kann zumeist auf bekannte Verfahren der Klassifikation zurückgegriffen werden . Entscheidend für den Erfolg ist die Bereitstellung eines informationstragenden Merkmalssatzes W. Wie bei einer solchen Art von Problemstellung üblich, muss ein Kompromiss zwischen einer niedrigen Fehlerrate und einer hohen Interpretierbarkeit der Ergebnisse, sowie einem möglichst geringen Rechenaufwand gefunden werden. Die Eingangsgrößen bei dieser Modulkategorie sind die vorverarbeiteten Merkmale W und die Ausgangsgrößen sind die Klassenzuweisungen der Planfaktoren Ŷ bzw. der Störfaktoren Ẑ (vgl. auch Formel (2.28)).
  Klassifikation
  Zur Durchführung der Klassifikation unbekannter Daten muss der Klassifikator zu Beginn mittels eines Lerndatensatzes angelernt werden. Die Frage nach der Anzahl an Versuchseinheiten, die hierfür notwendig ist, kann nicht pauschal beantwortet werden und hängt von den Eigenschaften und Störfaktoren der Hochdurchsatz-Untersuchung ab . In den meisten Fällen sind jedoch 20 bis 50 Versuchseinheiten einer Klasse ausreichend. Für das Labeln, also das manuelle Zuordnen einer Versuchseinheit der Lerndaten zu einer Klasse, wurde eine komfortable Softwarelösung entwickelt und in das Softwarepaket Gait-CAD implementiert (vgl. Abschnitt 4.4.1), welcher dem Anwender ein zufälliges Beispiel aus dem Datensatz zeigt und die Möglichkeit bereitstellt, per Mausklick einer der vorhandenen Ausgangsklassen zuzuweisen. So kann auf schnelle Weise für eine Hochdurchsatz-Untersuchung am Zebrabärbling der Lerndatensatz kreiert werden.
  Zur Klassifikation kommen vornehmlich Bayes-Klassifikatoren zum Einsatz, deren Aufgabe es ist, die Zugehörigkeit der Versuchseinheiten auf Basis der extrahierten, reellwertigen Merkmalswerte W einer der Klassen aus Y oder Z diskret zuzuordnen. Mittels des Lerndatensatzes wird ein hierfür funktioneller Zusammenhang bestimmt. Der Zusammenhang wird als Diskriminanzfunktion bezeichnet und ist entweder eine Entscheidungsfunktion, die den Merkmalswerten eine Klasse explizit zuordnet, oder besteht aus Distanzen zu den Klassen, welche die Zugehörigkeit implizit ausdrücken. Es wird eine Normalverteilung der Merkmale für jede Ausgangsklasse angenommen. Die Diskriminanzfunktion wird mittels der Mahalanobis-Distanz und klassenspezifischen Kovarianzmatrizen bestimmt . Im Anschluss lassen sich mittels Validierungsverfahren die Güte über unbekannte Datentupel abschätzen und die Auswirkungen zufälliger Störeinflüsse ermitteln .
  Regression der Dosis-Wirkungs-Kurve
  Oft ist es das Ziel, den Effekt des in der Hochdurchsatz-Untersuchung systematisch variierten Störfaktors Z auf einen oder mehrere Planfaktoren Y zu bestimmen. Bei Toxinen werden hier üblicherweise Verdünnungsreihen angelegt. Es kann auch der Effekt anderer Störfaktoren, wie z.B. Spannungen oder Temperaturen, beobachtet werden. Jede Versuchsreihe wird mit einer unterschiedlichen Konzentration (oder Dosis) ausgeführt. • den zugehörigen Faktoren,
  • dem Bildstrom,
  • den Zwischenergebnissen,
  • der Repräsentation des Nutzsignals (Nutzsignalzeitreihen bzw. Nutzsignalmerkmale),
  • der Zuordnung zu den Ausgangsklassen. 
  Grafische Oberfläche PIMP
  Die ebenfalls in MATLAB entworfene Auswertungseinheit PIMP ist als grafische Benutzeroberfläche implementiert und enthält Routinen zum komfortablen Einlesen der Videosequenzen, der Auswahl und der manuellen Adaption von Auswerteparametern sowie dem Ausführen der Berechnung anhand der gewählten Parameter. Die Bildsequenzen lassen sich sowohl einzeln als auch in Gruppen einlesen und prozessieren. Vor der Durchführung der Berechnung wird automatisch eine Vorschau erstellt, bei der das Ergebnis der Segmentierung direkt ersichtlich ist und anhand derer Parameter visuell, auch ohne Expertenwissen, angepasst werden können. 
  Bewertung
  Die vorgestellte Implementierung, die grafische Oberfläche und das Skalierungskonzept lassen sich für die Auswertung beliebiger Daten von Hochdurchsatz-Untersuchungen anwenden und falls notwendig adaptieren. Während das Werkzeug PIMP für den Photomotor Response Screen spezialisiert ist, lässt sich das Programmpaket Gait-CAD durch Plugins leicht auf neue Problemstellungen anpassen bzw. erweitern. Der grundlegende Ablauf vom Einlesen der Bilddaten bis hin zur Klassifikation bleibt hierbei identisch. Es muss für weitere Problemstellungen lediglich die Segmentierung ausgetauscht und anhand gelabelter Daten ein individueller Klassifikator entworfen werden. Somit steht nun, mit den vorgestellten Werkzeugen, eine zwar prototypische, jedoch vollständige Implementierung für Hochdurchsatz-Untersuchungen zur Verfügung. Eine erste Anwendung ist in zu finden. Im folgenden Kapitel werden die konzeptionellen und theoretischen Methoden an zwei praktischen Problemstellungen erprobt.
  Anwendungen
  Übersicht
  Um die Leistungsfähigkeit des neuen Konzeptes nachzuweisen, wird es im Folgenden auf zwei Probleme, die sich mit Hochdurchsatz-Untersuchungen lösen lassen, angewandt. Dabei werden die Problemstellung und damit der zu untersuchende Bilddatensatz jeweils komplexer. Die vorgestellten Projekte sind:
  • eine toxikologische Untersuchung anhand von Einzelaufnahmen von vereinzelten Zebrabärblingen (Abschnitt 5.2.2) und anhand von Bildsequenzen von vereinzelten Zebrabärblingen (Abschnitt 5.2.3).
  • eine Hochdurchsatz-Untersuchung anhand von Bildsequenzen von mehreren Zebrabärblingen (Abschnitt 5.3).
  iAlle Projekte werden mittels des eingeführten Konzeptes entworfen. Es folgt die Erstellung einer Auswertungskette durch Auswahl geeigneter Module aus Kapitel 3. Die Ergebnisse werden anschließend präsentiert und diskutiert. Weitere, nicht im Rahmen des Kapitels vorgestellte Anwendungen, auf die entweder direkt Einfluss genommen wurde oder die auf die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit aufbauen, finden sich in . Die Anwendungen wurden aus verschiedenen Gründen nicht in das Kapitel 5 aufgenommen: haben ihren Schwerpunkt weniger in der Bildverarbeitung und -analyse als in der Automatisierungstechnik. In der Anwendung von werden einige Aspekte des hier vorgestellten Konzeptes umgesetzt und eine Bildverarbeitungsroutine zur Erkennung des Herzschlags und zur Extraktion der Herzfrequenz erarbeitet. Obwohl die Ergebnisse vielversprechend sind, war deren Umfang zum Zeitpunkt des Entstehens der vorliegenden Arbeit noch nicht ausreichend für eine Aufnahme in das folgende Kapitel.
  Fisch Embryo Test (FET)
  Der Für die Einordnung der Lage der Larven werden in der vorliegenden Arbeit vier Klassen definiert. Die Einteilung der Klassen erfolgt anhand der oben definierten Merkmale durch Anwendung folgender Regeln, welche aus Erfahrungswerten abgeleitet sind: seitlich Die weitaus größte Anzahl der Larven liegt auf der Seite. Bezogen auf die eingeführten vier Merkmale liegt eine Larve seitlich, wenn ein Auge deutlich im Vordergrund zu sehen ist, während das andere nicht im Vordergrund ist und sich im optimalen Fall sogar deckungsgleich auf der " Rückseite" der Larve befindet. Beim Merkmal der Augen wird das Auge, welches einen größeren Anteil an Pixeln im Vordergrund aufweist, als Auge 1 und das andere als Auge 2 bezeichnet. Somit ist für das Merkmal Auge bei der Klasse Seitlich Auge 1 zu mehr als 90% im Vordergrund festgelegt, während von Auge 2 nicht mehr als 5% im Vordergrund erkennbar sein darf. Der Dottersack ist immer im Bild sichtbar und kann lediglich durch den Schwanz oder den Rücken teilweise überdeckt werden. Da bei seitlicher Lage der Rücken zumeist über der Larve liegt, sollte der Dottersack nicht oder nur unwesentlich verdeckt sein. Als zusätzliches Kriterium ist somit eine Sichtbarkeit des Dottersacks von 80% festgelegt. Eine weitere Voraussetzung für die seitliche Lage ist, dass der Rücken zu mehr als 50% über dem Dottersack sichtbar ist und sich weder vor noch hinter anderen Körperteilen befindet. Da bei einer Überdeckung der Organe der Larve durch deren Schwanz solche wichtigen Bereiche im vorderen Teil der Larve nicht erkennbar werden, wird gefordert, dass die Überdeckung des Schwanzes 5% des Volumens der Larve nicht überschreiten darf. undefiniert Larven, die sich keiner der übrigen vier Klassen zuordnen lassen, wurden als undefiniert klassifiziert. Die klare Zuordnung scheitert in vielen Fällen dann, wenn die Larve schräg oder verdreht im Ei liegt. der Larven passen in keine der definierten Klassen. Eine Bildauswertung, die Nutzsignale in der Larve auswertet, muss daher von der Lage der Larven unabhängig sein, wenn keine Larven aufgrund der Lage verworfen werden sollen. Bei einer automatischen Erkennung der vier beschriebenen Klassen können zwar etwa 75% der Larven ausgewertet werden, allerdings setzt dies voraus, dass das Nutzsignal ebenfalls in jeder Lage sichtbar ist. Des Weiteren muss für jede auszuwertende Klasse eine gesonderte Bildauswertung entwickelt werden. Eine Beschränkung auf die häufigste Klasse hätte einen sehr hohen Ausschuss an Einzeluntersuchungen zur Folge, da etwa die Hälfte aller Versuche nicht ausgewertet werden können, was den Durchsatz halbiert. Beide Optionen eignen sich somit wegen des hohen Entwicklungs-bzw. Kostenaufwands nicht für den Praxiseinsatz. Zusammenfassend zeigt die Untersuchung, dass Larven im Ei sich für Hochdurchsatz-Untersuchungen nur eignen, wenn deren Nutzsignal unabhängig von der Lage der Larve sichtbar bzw. quantifizierbar ist. Für alle anderen Untersuchungen in der Larve muss auf einen zusätzlichen Präparationsschritt zurückgegriffen werden, um eine definierte Position sicherzustellen. Das Ergebnis ist somit, dass unter Verwendung des vorliegenden Datensatzes eine Auswertung nur Erfolg verspricht, wenn lageunabhängige Merkmale für jeden Endpunkt gefunden werden. Ist das nicht möglich, muss die Biologie und Bildakquise erneut mit einem höheren Informationsgehalt, beispielsweise im 3D-Raum, durchgeführt oder unter Verwendung von fluoreszierenden Markern erfolgen, welche weniger empfindlich auf Verdrehungen der Probe reagieren, wie z.B. in gezeigt .
  Klasse Augen Dottersack Rücken Schwanz Anzahl Auge 1 Auge 2 seitlich >=90 % <= 5 % >=80 % >=50 % <=5 % 133 von oben >=90 % >=60 % <=60 % >=50 % <=5 % 15 von unten >=90 % >=60 % >=80 % >=20 % <=5 % 13 hinten <=10 % <= 5% >=50% 0 -100% 0 -100%18
  Fisch Embryo Test (FET) -Koagulation & EC 50 Regression
  Der FET soll in einer Hochdurchsatz-Untersuchung zur Ermittlung der Sterberate bei unterschiedlichen Konzentrationen für mehrere Toxine eingesetzt werden. Zebrabärblingseier sollen hierzu einzeln auf Koagulation untersucht werden und der Einfluss der Toxine bei steigender Konzentration ist zu bestimmen. Im Allgemeinen werden sich bei einer sehr niedrigen Konzentration fast alle Larven normal entwickeln (Sterberate bei wenigen Prozent), während bei einer sehr hohen Konzentration keiner der untersuchten Modellorganismen überlebensfähig ist (Sterberate 100%). Die zu untersuchenden Toxine und die Verdünnungsreihen je Konzentration sind in Tabelle 5.2 gegeben. Die Untersuchungen wurden am KIT durchgeführt.
  Toxin Einheit Dosis
  As2O3
  [mM] 0.80 0.90 1.00 
  Versuchsplanung: Biologie und Bildakquise
  Die Bestimmung des biologischen Effekts, d.h. des Nutzsignals, ist nach der eingeführten Vorgehensweise der erste Schritt und beim FET durch die OECD-Norm bereits durchgeführt. Ein Beispiel der zu unterscheidenden Fälle ist in Abb. 5.2a gegeben. Der markanteste Unterschied zwischen einer sich entwickelnden Larve und dem Eintreten der Koagulation ist der schwarze Punkt im Zentrum des Eies. Die Anforderungen (vgl. Abschnitt 2.3) für die Durchführung können als erfüllt betrachtet werden, da die Versuche der OECD-Norm den Gesetzmäßigkeiten entsprechen (Legitimität), die Larven in ausreichender Menge zur Verfügung stehen (logistische Machbarkeit), die Endpunkte reproduziert werden können (Reproduzierbarkeit) und auch die notwendigen Ressourcen zur Verfügung stehen (Finanzielle Realisierbarkeit). Nach der Akquise eines Bildstroms wird überprüft, ob die Anforderungen der Messung erfüllt sind: In Abschnitt 5.2.1 wurde gezeigt, dass sich die akquirierten Daten für die Hochdurchsatz-Untersuchung eignen, unter der Voraussetzung, dass sich signifikante Merkmale extrahieren lassen, welche von der Lage der Zebrabärblinge unabhängig sind (Eindeutige Präsenz der biologischen Information). Da keine fluoreszierenden Marker eingesetzt werden und die Lichtmikroskopie keine bekannten toxischen Auswirkungen auf die Fische hat , sind keine Effekte von der Bildakquise auf die Zebrabärblinge zu erwarten (Rückwirkungsfreiheit der Messung). Die Automatisierung der Mikroskopie mittels der Robotertechnik des Olympus-Scan R soll eine hinreichend schnelle Messung sicherstellen. Die benötigte Zeit zur Messung eines Versuchs ist wie im Konzept beschrieben (vgl. Abschnitt 2.5 Gleichung (2.6)) die Summe aus manuellen Präparationsschritten und der Dauer der Bild-Akquise. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die Präparationszeit für eine komplette Mikrotiterplatte zu bestimmen, denn typischerweise wird eine bestimmte Anzahl solcher Platten pro Tag verarbeitet und der Tagesablauf bei der Versuchsdurchführung hiernach ausgerichtet. Da bei der durchgeführten Hochdurchsatz-Untersuchung keine manuelle Ausrichtung der Larven erfolgt, sind, bezüglich der Präparationsschritte, lediglich die Dauer für die manuelle Vereinzelung (t p 1 = ca. 6s pro Näpfchen) und für das manuelle Hinzufügen der Chemikalien (t p 2 = ca. 3s pro Näpfchen) zu berücksichtigen. Die Dauer der Bildakquise ist abhängig von der Anzahl zu akquirierender Näpfchen pro Mikrotiterplatte (n w ), der Anzahl von Aufnahmen pro Näpfchen hintereinander (n z ) und der Anzahl von Wiederholungen 1 der gesamten Platte (n l ). Wird nun noch die Zeit ermittelt, welche das Olympus-Scan R -Mikroskop zur Aufnahme eines Bildes (t m 1 ), zum Bewegen zum nächsten Näpfchen (t m 3 ) sowie zum Bewegen an den Anfang der Mikrotiterplatte für eine Wiederholungsmessung benötigt (t m 2 ), so berechnet sich die Akquise-Dauer mittels der oben aufgelisteten Parameter näherungsweise 2 mittels: Auswertung & Klassifikation: Anhand der identifizierten trennstarken Merkmalskombination und der Trainingsdaten wurde ein Bayes-Klassifikator mit Berücksichtigung der klassenspezifischen Kovarianzmatrizen angelernt . Die Klassifikation zeigt auf den Testdaten in einer 5-fach-Crossvalidierung einen Klassifikationsfehler von 1.2±0.2% (niedrige Fehlerrate bei der Detektion des biologischen Effekts). In Abb. 5.5 ist ein Scatterplot der Trainingsdaten über die Merkmale x 7 und x 3 sowie die Diskriminanzfunktion des Klassifikators abgebildet. Die der Klasse koaguliert zugeordneten Larven zeigen für x 3 und x 7 deutlich geringere Werte als die der Klasse entwickelt zugeordneten. Die Diskriminanzfunktion des Bayesklassifikators ist ebenfalls abgebildet. Der Klassifikator kann nun bei Umdrehen" der Fische in eine zufällige Richtung interpretiert. Swimmings sind Bewegungen, bei denen die Larve, ohne große Drehungen auszuführen, sich auf der Stelle mit geringen Amplituden bewegt. Ein Swimming kann auch als eine Art " Zittern" beschrieben werden und wird als ein fiktives "
  t aq = n w •n z •n l • t m 1 + (n w − 1) •n l • t m 2 + (n l − 1) • t m 3(5.1)
  Flüchten" oder Wegschwimmen der Larve interpretiert. Nach der Anregungszeit erfolgt ein weiterer Lichtstimulus, auf welchen die Larven typischerweise nicht reagieren und der die vierte und letzte Phase einleitet, die sog. Refractory-Phase oder Resistenzzeit. In der letzten Phase sind die Larven nicht nur unempfindlich gegenüber dem zweiten Lichtstimulus, sondern die Anzahl der natürlichen, zufällig auftretenden Spontanbewegungen ist auch deutlich geringer, verglichen mit dem Ruhezustand zwischen 0 und 5 Sekunden. • charakteristische Bewegungsereignisse von einzelnen Larven zu klassifizieren sowie
  • Auftrittshäufigkeit und Dauer der Bewegungsereignisse einzelner Larven zu bestimmen.
  Hierzu ist es notwendig,
  • einzelne Larven in den Bildsequenzen zu finden und
  • Merkmale zur Quantifizierung der Bewegung zu extrahieren.
  Da in . In findet sich zudem eine genauere biologische Interpretation der o.g. Werte.
  In Kapitel 5 wurde die Funktionsweise des in der vorliegenden Arbeit neu entwickelten Konzeptes aus Kapitel 2 anhand von zwei realen Problemstellungen mit jeweils steigender Komplexität belegt. Für die Untersuchungen steht nun eine automatische und aussagekräftige Auswerteroutine zur Verfügung. Auf die Ergebnisse beider Projekte wird im Folgenden gesondert eingegangen. Abschließend werden die Ergebnisse beider Untersuchungen zu einer Klassifikatorkaskade kombiniert (vgl. Abb. 5.15), mit der nun erstmals die bildbasierte automatisierte Auswertung des FET anhand von drei Endpunkten zur Verfügung steht.
  Fisch Embryo Test
  Photomoter Response
  In Abschnitt 5.3 wurde das in der vorliegenden Arbeit erarbeitete Konzept aus Kapitel 2 erneut erfolgreich angewandt. Nach der Anwendung auf Einzelaufnahmen und der anschließenden Erweiterung auf Bildsequenzen für vereinzelte Zebrabärblingslarven innerhalb der Versuche des FET in Abschnitt 5.2 ist es nun erstmals möglich, einzelne Larven auch ohne vorherige manuelle Vereinzelung zu untersuchen. Für den PMR bedeutet das, bei unverändertem Durchsatz, eine erhebliche Verringerung der Fehlereinflüsse und eine deutliche Verbesserung der Aussagekraft verglichen mit dem in vorgestellten Verfahren. Die verbesserte Aussagekraft des in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Verfahrens trug direkt zur Identifikation sog. Response Cells im Rautenhirn (engl. Hindbrain) bei, welche für die Auslösung der stereotypen Antwort der Zebrabärblinge auf Lichtimpulse verantwortlich sind . Die Kernpunkte der vorliegenden Arbeit umfassen:
  • Die Entwicklung eines Konzeptes zur strukturierten Versuchsauslegung für die Hochdurchsatz-Untersuchung am Zebrabärbling (Kapitel 2).
  • Die Entwicklung neuer robuster, hochdurchsatzfähiger Bildverarbeitungsmodule für Untersuchungen am Zebrabärbling (Kapitel 3).
  • Die Implementierung der Algorithmen zur skalierbaren Anwendung auf Hochdurchsatz-Untersuchungen (Kapitel 4) sowie
  • die Anwendung und der Nachweis der Leistungsfähigkeit des Konzeptes und der Module auf zwei exemplarische biologische Problemstellungen (Kapitel 5).
  Die wichtigsten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind:
  1. Entwicklung eines neuen Konzeptes zum systematischen Entwurf einer Hochdurchsatz-Prozesskette aus Versuchsplanung, Versuchsvorbereitung, Datenerfassung, Datenverarbeitung und Evaluation. 
  Symbolverzeichnis
  Literaturverzeichnis
  Merkmal
  Güte-MANOVA 
  Güte
  Raum der reellen Zahlen
  RV
  Reale Werte des Einzelversuchs
  Raum welcher den realen Einzelversuch beschreibt
  