TLC의 원리는 주로 흡착과 분배이다. 고정상을 얇게 입힌 TLC 판에 검체를 떨어뜨리고 공기나 질소 아래에서 건조시킨다. 자외선이나 발색시약을 이용해 표준물질의 전개위치를 확인하고 기기분석을 시행한다. TLC는 처리과정의 번거로움이 있으나 다수의 검체 정제가 가능하다는 장점이 있다. 간섭물질의 양이 상대적으로 적은 검체 정제에 유용하다.
TLC의 원리는 column chromatography와 동일하나, 형태상 겔 침투 및 이온교환의 분리 양식은 적용하기 힘들며 주로 흡착과 분배가 분리 원리이다. 고정상 (주로 silica gel) 을 얇게 (보통 0.5∼1 mm) 입힌 TLC판에 소량 (약 0.5 mL)의 휘발성 유기 용매에 용해한 검체를 모세관이나 미세주사기를 이용하여 TLC판 하단 약 3cm 높이에 소량씩 점적 (spot) 또는 띠모양 (band)으로 떨어뜨리고 공기나 질소기류 하에서 건조시킨다. 이때 분석 대상성분의 표준 용액을 대조구로 판의 별도의 위치에 함께 처리한다. 검체를 처리한 TLC판은 전개용매가 담긴 chamber에 넣고 뚜껑을 덮어 밀폐하면 전개용매가 모세관 현상에 의하여 흡착제를 적시면서 판을 상승한다. 약 10∼15 cm 상방 전개 후 판을 꺼내어 건조하고 자외선을 조사하거나 발색시약을 사용하여 표준물질의 전개위치를 확인한다. 표준물질의 Rf값을 기준으로 분석 대상 동물용의약품에 해당하는 부위를 긁어내어 적당량의 유기용매로 추출한 후 기기분석에 적용한다. TLC는 그 검체 처리과정이 다소 번거롭고 검체 주입량도 제한적이기는 하나 좁은 장소에서 한 번에 다수의 검체를 간편하게 정제할 수 있다는 장점이 있다. 분리 효율은 우수한 편이며 간섭물질의 양이 비교적 적은 다수 검체의 정제에 편리하다.